CRISPR) ni mbinu ya uhariri wa jenomu ya kizazi cha tatu: CRISPR ilibadilisha ulimwengu

Kurudia kwa muda mfupi wa palindromic mara kwa mara (CRISPR) ni mbinu ya uhariri wa jenomu ya kizazi cha tatu ambayo imebadilisha ulimwengu kwa matokeo yake ya kiwango cha juu. Imetumika kutibu magonjwa na maambukizi mbalimbali ya kibiolojia. Bakteria mbalimbali na prokaryoti zingine (kama vile archaea) pia zina mifumo ya CRISPR/Cas9 ya kujikinga dhidi ya phaji. Imeripotiwa kuwa mikakati inayotegemea CRISPR/Cas9 inaweza kuzuia ukuaji na kuendelea kwa saratani ya matiti hasi mara tatu (TNBC) kwa kulenga jeni za upinzani zinazoweza kubadilika, unukuzi, na kanuni za epigenetic. Hatua hizi za matibabu zinaweza kusaidia kushughulikia matatizo magumu kama vile upinzani wa dawa unaoonekana hata katika TNBC. Hivi sasa, mbinu mbalimbali zinatumika kutoa CRISPR/Cas9 kwa seli zinazolenga, kama vile kimwili (njia ndogo, umeme na njia za hydrodynamic), virusi (virusi vinavyohusishwa na adeno na lentivirus) na visivyo vya virusi (liposomu na chembe chembe za lipidi). Ingawa mifumo mbalimbali imetengenezwa ili kusoma sababu za molekuli za TNBC, ukosefu wa mbinu nyeti na zinazolengwa za kutoa zana za uhariri wa jenomu mwilini hupunguza matumizi yao ya kliniki. Kwa muhtasari, tathmini hii inachunguza kwa kina maendeleo, changamoto, mapungufu, na matarajio ya matibabu ya CRISPR/Cas9 kwa TNBC kulingana na ushahidi uliopo. Pia tunaangazia jinsi mchanganyiko wa akili bandia na ujifunzaji wa mashine unavyoweza kuboresha mikakati ya CRISPR/Cas9 katika matibabu ya TNBC.
Saratani ina sifa ya mgawanyiko wa seli usiodhibitiwa, kuvurugika kwa vituo vya ukaguzi wa seli, na mabadiliko katika jeni za kuzuia uvimbe (TSGs) (Matthews et al., 2022). Miongoni mwa aina tofauti za saratani, saratani ya matiti ndiyo aina ya kawaida ya saratani kwa wanawake na ina kiwango cha juu cha vifo duniani kote (Waks and Winer, 2019). Saratani ya matiti ni ugonjwa usio wa kawaida wenye sifa mbalimbali, kama vile sifa za kihistolojia na kibiolojia, uwasilishaji wa kliniki na tabia, na mwitikio wa matibabu (Weigelt et al., 2010). Uainishaji wa saratani ya matiti hutoa ufahamu sahihi wa utambuzi wa saratani ya matiti na ubashiri wa uvimbe. Matumizi ya alama za kawaida za kibayolojia na sifa za kliniki yamekuwa kigezo kikuu cha uainishaji wa saratani ya matiti (Tsang na Tse, 2019). Utabiri na mwitikio wa matibabu ya saratani ya matiti huathiriwa na mambo mengi, ikiwa ni pamoja na uwepo wa kipokezi cha estrojeni (ER), kipokezi cha progesterone (PR), kipokezi cha kipengele cha ukuaji wa epidermal cha binadamu 2 (HER2/neu), na daraja la histolojia, aina ya uvimbe, na daraja. Ukubwa na metastasis ya nodi za limfu (Al-Tubaiti, 2020). Aina tano za ndani za molekuli za saratani ya matiti zimetambuliwa, ikiwa ni pamoja na luminal A, luminal B, HER2-enriched, basal-like, na claudin-low (Prat et al., 2015). TNBC ni aina ya molekuli ya saratani ambayo haionyeshi ER, PR, na HER2 zote (Yin et al., 2020). Sifa hizi za kiolojia zinahusishwa na TNBC, ikithibitisha ukuaji wake wa haraka na asili yake kali zaidi kuliko aina nyingine yoyote ya saratani ya matiti (Feng et al., 2018). Zaidi ya hayo, Peru et al (2000) walitumia teknolojia ya microarray kuainisha upya saratani ya matiti na kutambua aina tano za ndani za saratani ya matiti (Cadenas, 2012). Saratani ya matiti inayofanana na basal ni aina ya saratani ya matiti ambayo ina phenotype hasi mara tatu na inahusishwa na ukuaji wa haraka. Ikumbukwe kwamba saratani zote za matiti zinazofanana na basal kwa kawaida hutambuliwa vibaya kama TNBC, lakini ni 77% pekee ndizo TNBC; Kwa upande mwingine, 71–91% ya TNBC zinafanana na basal, ikionyesha kwamba aina hizi mbili za saratani ya matiti huingiliana na zinawakilisha uainishaji tofauti (Wang D.-Y. et al., 2019). Hii inaunda hitaji la kuainisha tofauti za TNBC ili kufafanua ubashiri na kutambua majibu yanayowezekana kwa matibabu ya sasa na ya baadaye. Zaidi ya hayo, TNBC inachangia 15–20% ya visa vyote vya saratani ya matiti na ni kawaida zaidi kwa wanawake walio chini ya umri wa miaka 50. Mabadiliko ya BRCA1 au BRCA2 yameripotiwa katika takriban 20% ya visa vya TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Uchunguzi pia umeonyesha kuwa TNBC ina mazingira madogo ya kinga ambayo yanajumuisha viwango vya juu vya vipengele vya ukuaji wa endothelial ya mishipa, macrophages zinazohusiana na uvimbe (TAMs), limfositi zinazoingia kwenye uvimbe (TILs), na molekuli zingine zinazohusika katika ukuaji na uhamiaji wa uvimbe. Kwa hivyo, kuelewa mazingira madogo ya TNBC ni muhimu kwa ubashiri na matibabu yake (Fan na He, 2022).
Ili kutathmini ubashiri wa TNBC na kuhakikisha matibabu bora, utambuzi sahihi, hasa kulingana na immunohistochemistry (IHC) ili kugundua ER, PR na HER2, na mammografia ili kugundua uvimbe wa matiti, ni muhimu. Hata hivyo, mammografia haiwezi kuonyesha vya kutosha sifa za ndani ya uvimbe kama vile necrosis na fibrosis (Deepak Singh et al., 2021). Kwa kuwa ubashiri mbaya na utambuzi huzuia madaktari kuagiza dawa sahihi (Chaudhary, 2020), mikakati mbalimbali hutumiwa kuboresha huduma kwa wagonjwa walio na TNBC. Hivi sasa, dawa mbili, doxorubicin na cyclophosphamide, zinatumika kwa wagonjwa walio na TNBC na zimeonyesha matokeo mazuri. Kwa kuongezea, dawa zingine za platinamu zinatumika, kama vile carboplatin na cisplatin (Sikov et al., 2015). Kwa kuongezea, vizuizi vya PARP kama vile Olaparib, Velaparib, na PF-01367338 vimetumika kama dawa zinazowezekana za kidini kwa ajili ya matibabu ya TNBC (Ishino et al., 2018). Kwa kuwa njia za kuashiria Wnt/b-Catenin, NOTCH, na Hedgehog zimeripotiwa kuhusika katika kutokea na kuendelea kwa TNBC, kulenga dawa kwenye njia hizi kunaweza kuwa mkakati muhimu (Aysola et al., 2013). Ingawa upasuaji, tiba ya mionzi na chemotherapy zinabaki kuwa msingi wa matibabu kwa TNBC leo, maendeleo makubwa yamefanywa katika kutengeneza matibabu mapya ikiwa ni pamoja na tiba lengwa, tiba ya kinga mwilini, zana mbalimbali za uhariri wa jeni zinazohusiana na CRISPR kama vile Cas9n, dCas9., CRISPR/Cas12, uhariri mkuu, na tiba ya jeni inayolengwa na CRISPR/Cas9. Hapa tutazingatia zana mbalimbali za uhariri wa jeni zinazohusiana na CRISPR zinazotumika katika matibabu ya TNBC. Miongoni mwao, CRISPR/Cas9 imepokea umakini mkubwa.
Cas9n, ambayo pia inajulikana kama Cas9 nickase, ni aina tofauti ya protini ya Cas9 iliyobuniwa kijeni inayotokana na mfumo wa uhariri wa jenomu wa CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). Katika umbo lake la asili, protini ya Cas9 ina vikoa viwili vya nuclease: RuvC na HNH, kazi yake kuu ni mgawanyiko wa nyuzi zote mbili za DNA. Hata hivyo, katika Cas9n, moja ya vikoa vya nuclease, HNH, hubadilishwa kijeni na kuwa hai. Kwa hivyo, kikoa cha HNH cha Cas9n kinabaki kisichofanya kazi. Ni kikoa cha RuvC pekee kinachobaki hai, na kuruhusu Cas9n kukata au kuunda mipasuko kwenye nyuzi moja ya DNA (Trevino na Zhang, 2014). Ikilinganishwa na Cas9, Cas9n inaweza kupunguza kwa ufanisi athari zisizolengwa na kuboresha kwa usahihi mifumo ya urekebishaji wa seli. Cas9n inaweza kutumika kutatua matatizo mbalimbali, kama vile kuunda mipasuko katika maeneo maalum katika DNA yenye nyuzi mbili. Kwa kusudi hili, molekuli mbili za Cas9n ziliunganishwa na kutumika pamoja (Yee, 2016). Kinasi ya mstari mchanganyiko 3 (MLK3) ni kinasi ya protini inayoamilishwa na mitojeni ambayo hutumika kama kidhibiti muhimu wakati wa metastasis ya TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 inaweza kuamsha njia nyingi za kuashiria zinazosababisha metastasis ya TNBC. Kwa mfano, njia ya c-Jun N-terminal kinase (JNK) hudhibiti uhamaji wa seli na uharibifu wa matrix ya nje ya seli, na MLK3 huamsha njia ya JNK, na hivyo kuongeza uhamaji wa seli na kutoa sifa vamizi (Rattanasinchai na Gallo, 2016). MLK3 pia hudhibiti EMT. Ili kufanya hivyo, inaamsha vipengele vya unukuzi vya chini kama vile Konokono, Slug na Twist. Vipengele hivi huzuia usemi wa alama za epithelial na kukuza usemi wa alama za mesenchymal, na kusababisha kupatikana kwa phenotype iliyoenea (Casalino et al., 2023). MLK3 imeonekana kuchukua jukumu katika urekebishaji wa ECM na uanzishaji wa proteni kama vile metalloproteinases za matrix (MMPs) ambazo huharibu ECM. Hii hurahisisha uvamizi wa seli za uvimbe na kuenea hadi maeneo ya mbali (Katari et al., 2019). Kwa hivyo, tafiti za awali zimeonyesha kuwa MLK3 ina jukumu muhimu katika TNBC. Rattanasinchai na Gallo walitumia mifumo ya TNBC kusoma jukumu la MLK3 na waligundua kuwa inakuza ukuaji wa saratani kupitia njia maalum za kuashiria. Walitumia CRISPR/Cas9n kuhariri MLK3 na waliona kupungua kwa kiasi kikubwa kwa metastasis ya TNBC (Rattanasinchai na Gallo, 2016).
dCas9, ambayo mara nyingi huitwa Cas9 isiyofanya kazi, ni aina iliyobadilishwa ya protini ya Cas9. Tofauti na Cas9 hai, dCas9 haina shughuli ya endonuklease, na kuifanya isiweze kusababisha kuvunjika kwa nyuzi mbili za DNA. Kwa hivyo, dCas9 inaweza kutumika kulenga maeneo maalum ya jenomu bila mabadiliko au marekebisho yoyote kwenye mfuatano wa DNA (Wang et al., 2016). Katika dCas9, protini mbili za endonuklease, RuvC na HNH, haziamilishwi kwa kukandamiza mabaki muhimu ya amino asidi. (Richter et al., 2016). Licha ya ukosefu wake wa shughuli ya mgawanyiko wa DNA, dCas9 ina majukumu kadhaa muhimu katika utafiti wa kijenetiki na bioteknolojia. Kwa mfano, inaruhusu taswira ya maeneo maalum ya jenomu, hurahisisha udhibiti wa unukuzi, na kukuza marekebisho ya epigenetic (Brocken et al., 2018).
Kipengele cha unukuzi ZEB1 (kisanduku cha E kinachounganisha kidole cha zinki na kisanduku cha nyumbani 1) kina jukumu maalum na muhimu katika kupatanisha mpito wa epithelial-mesenchymal (EMT), mchakato wa seli unaotokea wakati wa ukuaji wa kiinitete, ukarabati wa tishu, na ukuaji wa saratani. Inahusisha ubadilishaji wa seli za epithelial kuwa seli za mesenchymal, na kusababisha mabadiliko katika umbo la seli, mwendo, uvamizi, n.k. (Wu et al., 2020). ZEB1 huzuia alama nyingi za epithelial, kama vile E-cadherin na Occludin, ambazo zina jukumu la kudumisha mshikamano wa seli-seli na polarity ya seli za epithelial katika TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Kwa kuongezea, ZEB1 huamsha alama fulani kama vile N-cadherin, vimentin na fibronectin (Konradi et al., 2014) na pia hudhibiti jeni zinazohusika katika uundaji upya wa saitoskeletal kama vile Rho GTPases na matrix metalloproteinases (MMPs) (Huang). et al., 2014). 2022), kwa kuongezea, pia huathiri njia mbalimbali za kuashiria kama vile kubadilisha kipengele cha ukuaji-β (TGF-β), ishara ya Wnt, n.k., na hivyo kukuza uvamizi wa uvimbe na metastasis katika TNBC (Chen et al., 2016). Tafiti nyingi na ushahidi wa kisayansi zinaonyesha kuwa ZEB1 ina uwezo mkubwa kama wakala muhimu kwa ajili ya kugundua na kuingilia kati kwa matibabu ya TNBC. Katika utafiti wa hivi karibuni, Waryah et al. walitumia mfumo wa TNBC na kufikia kukandamiza kabisa ZEB1 na dCas9. Kwa hivyo, waliona umaalum wa juu sana na kizuizi karibu kabisa cha ZEB1 katika hali za ndani ya mwili (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 ni kifaa cha kuhariri jeni kinachoitwa CRISPR/Cpf1. Kinatokana na mfumo wa CRISPR/Cas, ambapo neno Cas12 linarejelea protini 12 inayohusiana na CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), ambayo inafanana kabisa na Cas9. Tofauti pekee ni kwamba ina protini ya Cas12. Ikilinganishwa na Cas9, Cas12 ina kazi za kipekee kama vile kutoa ncha zinazonata wakati wa mchakato wa kuhariri jeni, ilhali Cas9 hutoa ncha butu (Wang et al., 2021). Sifa hii ya Cas12 inachangia teknolojia yake maalum ya urekebishaji wa DNA. Kama protini inayoweza kutambua na kukata DNA lengwa kwa usahihi, ina utofautishaji wa ajabu, na kuifanya kuwa kifaa bora kwa matumizi mbalimbali, ikiwa ni pamoja na uhariri wa jeni (Pickar-Oliver na Gersbach, 2019).
Sawa na aina zingine za CRISPR, CRISPR/Cas12 pia ina uwezo wa kuondoa au kuamsha jeni katika TNBC, ikilenga jeni zinazochukua jukumu muhimu katika pathogenesis yake au mwitikio wa matibabu (Yang na Zhang, 2023). Ili kukamilisha mchakato huu, RNA mwongozo (gRNA) ilitengenezwa ambayo inaelekeza Cas12 kwenye jeni lengwa. Mara tu Cas12 inapojifunga kwenye shabaha yake, huanzisha mapumziko ya nyuzi mbili katika DNA na kuamsha mifumo ya urekebishaji wa DNA. Wakati wa mchakato wa urekebishaji, nyukleotidi zisizo sahihi zinaweza kuingizwa, na kusababisha mabadiliko ya jeni na upotevu wa utendaji kazi (Zhang et al., 2021a). Kwa kuongezea, toleo lililoboreshwa la kimeng'enya cha Cas12 (kinachoitwa dCas12) pia lilitumika kuamsha jeni. Kwa kuichanganya na kiamilishi cha unukuzi, inawezekana kushawishi jeni fulani, na hivyo kuziamilisha. Teknolojia hii ina uwezo mkubwa katika kukuza uanzishaji wa jeni za kuzuia uvimbe (Sultan et al., 2022).
Uhariri mkuu ni teknolojia mpya na bora zaidi ya uhariri wa jenomu. Ina uwezo wa kurekebisha DNA ya kiumbe kwa usahihi kabisa (Chen na Liu, 2023). Uhariri mkuu hupatikana kupitia ujumuishaji wa vipengele viwili vikuu: kimeng'enya cha CRISPR/Cas9 kilichorekebishwa na transcriptase ya kinyume. Jukumu la kimeng'enya cha CRISPR/Cas9 ni kulenga maeneo sahihi katika jenomu kwa kuchagua, huku reverse transcriptase ikisaidia kurekebisha DNA kikamilifu katika eneo lengwa (Hassan et al., 2021). Katika utaratibu wa uhariri mkuu, hatua ya kwanza inahusisha uundaji wa mwongozo wa uhariri mkuu wa RNA (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Ina mfuatano lengwa na kiolezo cha RNA kinacholingana na eneo linalohitajika la uhariri katika DNA lengwa. Kisha pegRNA huingizwa kwenye seli lengwa pamoja na nuclease ya uhariri mkuu (PE2). PE2 ni protini ya muunganiko inayojumuisha kimeng'enya cha Cas9, reverse transcriptase, na adapta ya uhariri mkuu (Martín-Alonso et al., 2021). Ndani ya seli, pegRNA na PE2 complexes hutafuta DNA maalum wanayotaka kurekebisha. Kimeng'enya cha Cas9 hukata DNA na kuunda template inayojumuisha nyuzi moja (Choi et al., 2022). Reverse transcriptase hutumia template hii kuandaa DNA kwa ajili ya kuhariri. Pamoja na kunakili DNA, maagizo ya kuhariri template ya RNA pia yamejumuishwa. Hatimaye, nyuzi mpya ya DNA iliyoundwa hutumika kama template kurekebisha mgawanyiko katika DNA, na kusababisha mfuatano wa DNA uliobadilishwa wenye marekebisho yanayotakiwa (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Mifumo ya uhariri wa primer inaweza kusababisha mabadiliko makubwa katika jeni. Inaweza kulenga mabadiliko ya nukta, viingizo, ufutaji, na hata uingizwaji wa jeni (Anzalone et al., 2019; Chen na Liu, 2023). Uhariri wa primer hutoa faida kadhaa zaidi ya teknolojia za awali za uhariri wa jenomu. Hizi ni pamoja na usahihi ulioongezeka, kupungua kwa athari zisizo za lengo, na uwezo wa kuhariri DNA bila kutegemea mapumziko ya nyuzi mbili za DNA (Anzalone et al., 2020).
Teknolojia ya CRISPR/Cas9 ilitengenezwa awali ili kulinda bakteria kutokana na uhamisho wa plasmidi na maambukizi ya phaji na baadaye ilitumika tena kama zana bora ya kulenga DNA inayotegemea RNA kwa ajili ya uhariri wa jenomu (Jiang na Doudna, 2017). Zaidi ya hayo, mfumo wa CRISPR/Cas9 umeripotiwa kuwepo katika 50% na 87% ya jenomu za bakteria na za kale, mtawalia (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 ni zana inayowezekana ya kufuta, kuingiza na kurekebisha mfuatano wowote usio wa kawaida wa kijenetiki kwa kutumia njia za ndani ya mwili na ndani ya vitro (Sabit et al., 2021). Zaidi ya hayo, CRISPR/Cas9 imeonyeshwa kuwa sehemu ya mfumo wa kinga unaobadilika kutokana na umaalum wake kwa jeni lengwa zinazovutia (Chen na Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 ina Cas9 na RNA moja inayoongoza (sgRNA). Cas9 ni endonukleasi inayoundwa na vipengele vingi vya protini. Zaidi ya hayo, Cas9 ina sifa za kipekee za kimuundo na umbo (Pacesa et al., 2022) kwani ina lobes mbili: utambuzi (REC) na nuclease (NUC). Lobes ya REC imegawanywa zaidi katika maeneo matatu: REC1, REC2, na helikopta za daraja (Cromwell et al., 2018). NUC ina lobes tatu, ambazo ni RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH na kikoa cha mwingiliano cha motif iliyo karibu ya protospacer (PAM) (Mchoro 1) (Song et al., 2016). sgRNA ina vipengele viwili, ikiwa ni pamoja na CRISPR RNA (crRNA) na transcoding RNA ndogo (tracer RNA) (Mchoro 1). SgRNA huunganisha protini ya Cas9 na koneksini ili kuunda mchanganyiko hai, unaojulikana pia kama mchanganyiko wa athari (Richter et al., 2012). crRNA ni jozi ya msingi wa nyukleotidi 18-20 ambayo ina jukumu muhimu katika kutambua mfuatano wa DNA lengwa. Zaidi ya hayo, crRNA huunganishwa na DNA lengwa, na tracrRNA hufanya kazi kama jukwaa la nuklea ya Cas9 ili kufunga DNA lengwa (Manghwar et al., 2019). Kwa upande mwingine, mfuatano wa PAM una nyukleotidi 3, ambazo zinathibitisha, hubainisha na kupatanisha kufungamana kwa mchanganyiko wa athari na DNA. Vitengo vidogo vya protini ya Cas9 RuvC na HNH vina shughuli ya kichocheo (Richter et al., 2012; Asmamaw na Zawdie, 2021). Kikoa cha nuklea ya HNH cha kitengo kidogo cha Cas9 hukata kamba ya DNA inayohusishwa na crRNA. Kikoa cha nuclease cha RuvC hupasua nyuzi zingine za DNA na kutoa mipasuko ya nyuzi mbili (DSBs), baada ya hapo mifumo miwili tofauti ya urekebishaji wa mipasuko ya DNA huamilishwa (Jiang na Doudna, 2017) (Mchoro 1).
Mchoro 1. Muhtasari wa CRISPR/Cas9 (A). Vipengele vya mfumo wa CRISPR/Cas9: (i). Endonukleasi ya Cas9 inawajibika kwa kukata mfuatano wa DNA lengwa, (ii) RNA moja ya mwongozo (sg) inayotokana na muunganiko wa crRNA na tra-crRNA chimeras. (mbili). Cas9 inajumuisha vipengele kadhaa kama vile Rec I, Rec II, NUC lobe (HNH na Ruv C ni vipengele vidogo) na kikoa cha mwingiliano wa PAM (C) chenye kazi zinazolingana. Mchanganyiko wa protini ya CRISPR/Cas9 hugawanya mfuatano wa DNA katika aina zisizo za nyongeza na zinazosaidiana (D). CRISPR/Cas9 huhariri jenomu katika hatua tatu: utambuzi, kukata na kutengeneza. sg-RNA iliyoundwa huongoza Cas9 na kutambua mfuatano unaohitajika kupitia crRNA ya vipengele vinavyosaidiana. Cas9 hutambua mfuatano wa PAM katika 5′-NGG-3′ na kuyeyusha DNA, na kutengeneza mseto wa DNA-RNA na kuamsha mgawanyiko. Kikoa cha HNH cha Cas9 hukata kamba inayosaidiana, na kikoa cha RuvC hukata kamba isiyosaidiana. CRISPR/Cas9 hurekebisha dsDNA kwa kuivunja kwa njia mbili: kuunganisha ncha isiyo na homologous (NHEJ) na ukarabati unaoelekezwa na homologous (HDR). NHEJ hurekebisha DNA yenye nyuzi mbili bila DNA ya kigeni inayofanana kupitia mchakato wa kimeng'enya, utaratibu unaoweza kusababisha hitilafu ambao unaweza kuingiza au kuondoa mfuatano wa DNA nasibu. HDR ni maalum sana na inahitaji templeti za DNA zinazofanana.
Njia za ukarabati zinazosimamiwa na CRISPR/Cas9 zinajumuisha mifumo isiyo ya homologous ya kuunganisha ncha (NHEJ) na urekebishaji unaoongozwa na homolojia (HDR). NHEJ ni njia inayoweza kupata hitilafu kwa sababu inahusisha uingizaji au ufutaji na haihitaji muundo wowote wakati wa utaratibu wa ukarabati. Inatumia nyukleotidi nasibu kutoa protini za kawaida (Abbasi et al., 2021). Mfumo huu wa ukarabati una tata nne kama vile tata ya KU, tata ya protini inayokamilishana aina ya 4 (XRCC-4), kimeng'enya cha usindikaji wa mwisho wa DNA, na kinase ya protini DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Protini tata ya KU ina vitengo viwili vidogo, Ku 70 na Ku 80, na ina jukumu muhimu katika utaratibu wa NHEJ, kwa kuwa utaratibu wa ukarabati huanzishwa kwa kufungamana kwa vitengo viwili vidogo (Ku 70 na Ku 80) kwenye ncha butu au karibu butu za DNA lengwa (Abbasi et al., 2021), ikitumika kama jukwaa la kukusanya vipengele vingine vinavyohusiana na NHEJ kwenye eneo la jeraha (Yang et al., 2020). XRCC-4 na ligase ya DNA zinaundwa na amino asidi 334 na 911, mtawalia, na mchanganyiko wa XRCC4-DNA ligase IV huchochea kufungamana kwa ncha za DNA (Chatterjee et al., 2015). Kimeng'enya cha usindikaji wa mwisho wa DNA, pia kinachojulikana kama polynucleotide kinase 3′-phosphate, ni kimeng'enya cha usindikaji wa mwisho wa DNA. Inaweza kuondoa kundi la 3′P katika DNA na fosforasi kundi la 5′OH wakati wa ukarabati wa DSB. Pia inahusisha ukarabati wa vipande vya nyuzi moja (SSBs) kwa kutumia njia ya ukarabati wa SSB (Chatterjee et al., 2015). Kinasi ya protini DNA-PKcs ni kinasi ya protini inayotegemea DNA ambayo ina sehemu ndogo ya kichocheo ya PIKKs (kinasi zinazohusiana na phosphatidylinositol 3-kinase) na familia ya ataxia telangiectasia mutated (ATM), pamoja na ATR zinazohusiana na ATM na Rad3. vipande vya nyuzi (DSBs) na vipande vya nyuzi moja (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR ni utaratibu sahihi na unaofaa zaidi wa ukarabati kwa sababu taarifa hiyo inakiliwa kwa kutumia umbo kamili la duplex ya DNA ya homologous, ingawa inahitaji uwepo wa kromatidi dada. Hii hutokea wakati wa awamu ya S/G2 ya mzunguko wa seli za mamalia. HDR hutokea hasa katika spishi za chachu, lakini NHEJ ni muhimu kwa mamalia (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Utaratibu kamili wa ukarabati unaonyeshwa kwenye Mchoro 1.
Kwa kuwa TNBC husababishwa na kasoro za kijenetiki na epijenetiki, marekebisho ya kasoro mbaya za kijenetiki/epijenetiki kwa kutumia CRISPR/Cas9 yanaweza kuwa mbinu inayofaa ya matibabu (Chen et al., 2019). Kwa kuongezea, baadhi ya vipengele vya unukuzi vinavyohusika katika udhibiti wa unukuzi maalum wa seli vinaweza kuonyesha sifa za kipekee za seli za saratani, na kupendekeza kwamba udhibiti wa unukuzi unaweza kuwa mbinu bora ya matibabu ya saratani (Drost et al., 2017). Kutumia sifa hizi za molekuli za uvimbe, kama vile kasoro za kijenetiki, epijenetiki na unukuzi, kwa ajili ya maendeleo ya dawa kunaweza kuboresha matokeo ya kliniki na kupunguza gharama za uchunguzi. CRISPR ni zana inayowezekana ya uhariri wa jeni ambayo haiwezi tu kugundua na kutambua malengo ya kijenetiki yanayosababisha saratani, lakini pia inaweza kutumika kuhariri, kukandamiza, na kurekebisha onkojeni katika seli za binadamu (Jedwali 1) (Ahmed et al., 2021). Uchunguzi kadhaa wa CRISPR umefanywa ili kutafuta jeni zinazohusiana na vikandamizaji vya uvimbe, onkojeni, na upinzani wa dawa. Matumizi ya CRISPR/Cas9 kuhariri onkojeni mbalimbali za TNBC yanaonyeshwa kwenye Mchoro 2.
Mchoro 2. Uhariri wa jeni wa onkojeni mbalimbali za TNBC kwa kutumia CRISPR/Cas9 na kusababisha ukuaji mdogo wa uvimbe na metastasis. Onkojeni hizi ni pamoja na CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 na CXCR7, Crypto1, ROR1 na ST8SIA, ambazo zinahusika katika kutokea na metastasis ya TNBC.
Uhamiaji, uvamizi, na mpito wa epithelial-mesenchymal (EMT) wa seli za saratani unahusishwa na ITGA9. Uchunguzi wa awali umeonyesha kuwa ITGA9 ni mchezaji muhimu katika njia ya Notch na ina jukumu la kuvutia katika metastasis ya rhabdomyosarcoma (Molist et al., 2020). Zaidi ya hayo, ITGA9 iligunduliwa kuhusishwa kwa karibu na ubashiri wa mgonjwa katika aina kadhaa za uvimbe, ikiwa ni pamoja na saratani ya matiti (Wang Z. et al., 2019). Zaidi ya hayo, uchambuzi wa bioinformatiki wa ITGA9 ulionyesha kuwa usemi wake katika TNBC ulikuwa juu zaidi kuliko katika aina nyingine za saratani ya matiti. Viwango vilivyoinuliwa vya ITGA9 vinahusishwa na metastasis ya uvimbe na kurudi tena kwa wagonjwa wa TNBC. Kuondolewa kwa ITGA9 na CRISPR/Cas9 kulisababisha sifa kama za seli shina za saratani (CSC), angiogenesis ya uvimbe, ukuaji wa uvimbe, na metastasis iliyopunguzwa kwa kukuza uharibifu wa β-catenin katika TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 ni mwanachama wa familia ya TGF-β na ni muhimu kwa ajili ya uundaji wa kiinitete mapema, matengenezo ya seli shina, na metastasis ya saratani (Ishii et al., 2021). Pia inajulikana kama Tdgf-1, ni protini ya ishara ya GPI inayosababishwa na oncogenic inayohusika katika udhibiti wa uundaji wa mfuatano wa awali, mesoderm na endoderm, pamoja na uanzishwaji wa asymmetry ya kushoto/kulia katika ukuaji wa viungo vya mwili wakati wa uundaji wa kiinitete (Zhang et al., 2021b). Zaidi ya hayo, Cripto-1 imeonyeshwa kuhusika katika mpito wa epithelial-mesenchymal (EMT) kama alama ya seli shina (Zhang et al., 2021b). EMT ni muhimu si tu kwa michakato mbalimbali kama vile ukuaji wa kiinitete, fibrosis na uponyaji wa jeraha, lakini pia kwa uvamizi wa saratani na metastasis. Zaidi ya hayo, Cripto-1 imeonyeshwa kuingiliana na vipokezi vinne vya Notch na kuongeza kukomaa kwao baada ya utafsiri (Brandstadter na Maillard, 2019). Njia ya kuashiria Notch inajulikana kuhusika katika utunzaji wa seli za saratani ya matiti ya binadamu. Uchunguzi umeonyesha kuwa kukatika kwa Crypto-1 kunakosababishwa na CRISPR/Cas9 hukandamiza ukuaji wa saratani na metastasis. Kwa hivyo, Crypto-1 inaweza kuwa shabaha muhimu ya matibabu kwa TNBC (Castro et al., 2015).
Protini ya XCL12 na kipokezi chake cha chemokine CXC (CXCR4 na CXCR7) huchukua majukumu mbalimbali katika kuongezeka, ukuaji, uhamiaji na uvamizi wa seli za saratani (Wu et al., 2015). Vipokezi hivi vya chemo vimehusishwa na ukuaji wa TNBC kupitia njia nyingi za kuashiria katika mifumo ya ndani na ndani ya vitro (Wu et al., 2015). Kwa kuongezea, uanzishaji wa CXCR4 na CXCR7 unahusishwa na uwezekano mkubwa wa metastasis na ubashiri mbaya katika TNBC (Karn et al., 2022). Kwa hivyo, kutoweka kwa CXCR4 na CXCR7 kunaweza kuwa jeni lengwa la dawa linalofaa kwa matibabu ya saratani ya matiti, ikiwa ni pamoja na TNBC. Utafiti uliofanywa na Yang et al. Yang et al (2019) ulitumia CRISPR/Cas9 kugonga jeni za CXCR4 na CXCR7 na kugundua kuwa kuongezeka, ukuaji, uhamiaji na uvamizi wa TNBC kulizuiliwa kwa kiasi kikubwa (Yang et al., 2019).
Viwango vilivyoongezeka vya miR-3662, onkojeni ya TNBC, vilizingatiwa katika tishu za saratani ya matiti (Yi et al., 2022). Kupungua kwa miR-3662 kumeonyeshwa kuzuia ukuaji wa uvimbe wa saratani ya matiti na kuenea kwa metastasis katika mwili na katika vitro (Agarwal na Gupta, 2021). HBP-1 ni kizuizi chenye nguvu cha ishara ya Wnt/-catenin na kuna uwezekano mkubwa inawajibika kwa ukuaji wa seli za TNBC unaosababishwa na miR-3662. Hivi majuzi, Yi et al. waligundua kuwa mhimili wa miR-3662-HBP1 hudhibiti njia ya ishara ya Wnt/-catenin katika seli za TNBC (Yi et al., 2022). Kutokana na usemi wake maalum wa uvimbe, miR-3662 inaweza kuwa shabaha inayowezekana ya matibabu kwa TNBC. Kwa hivyo, kupungua kwa miR-3662 kunasababishwa na CRISPR/Cas9 kunaweza kuwa mbinu bora ya kutengeneza dawa mpya kwa ajili ya matibabu ya TNBC.
UBR5 ni nukleofosfoprotini ya 300 kDa ambayo imetambuliwa kama mdhibiti muhimu wa uundaji wa uvimbe, metastasis, na mwitikio wa kinga katika saratani mbalimbali (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5 imeripotiwa kuongezeka sana katika sampuli za TNBC na huchochea utendaji kazi wa ERα kwa kusababisha kuongezeka kupitia shughuli zake za ubiquitin ligase (Bolt et al., 2015). Uchunguzi mzima wa mpangilio wa exome wa sampuli za msingi za TNBC pia ulionyesha ongezeko la usemi wa UBR5, ikidokeza jukumu lake katika ukuzaji wa TNBC. Zaidi ya hayo, ufutaji wa UBR5 unaoendeshwa na CRISPR/Cas9 ulionyesha kizuizi kikubwa cha metastasis ya TNBC na ukuaji katika mifano ya majaribio ya panya. Zaidi ya hayo, kuingizwa kwa UBR5 katika modeli ya panya wa aina ya mwituni kulirejesha utendaji wake kamili, ilhali athari hii haikuonekana katika aina zisizoamilishwa za mutant (Liao et al., 2017). Ukosefu wa UBR5 unahusishwa na ongezeko la apoptosis, necrosis, na kizuizi cha ukuaji wa uvimbe katika TNBC kutokana na angiogenesis duni. Kutokana na kupotea kwa UBR5, kuenea kwa uvimbe hadi viungo vya mbali hupunguzwa, na UBR5 husababisha EMT isiyo ya kawaida hasa kwa kupunguza usemi wa E-cadherin (Zhang na Weinberg, 2018). Hivi majuzi, UBR5 ilionyeshwa kuwa jambo muhimu sana katika unukuzi wa PDL1 unaosababishwa na IFN-γ katika TNBC kutokana na ukosefu wake wa shughuli za ubiquitination ya E3. Uchambuzi wa transcriptome ya RNA ulionyesha kuwa UBR5 inaweza kuwa na athari za kimfumo kwenye jeni zinazohusiana na njia ya IFN-γ na kukuza uanzishaji wa PDL1 kwa kuongeza viwango vya uanzishaji wa protini kinase RNA (PKR) na vibadilishaji vyake vya ishara na viamilishi. unukuzi 1 (STAT1) na kipengele cha udhibiti wa interferon 1 (IRF1). Hata hivyo, uondoaji wa pamoja wa usemi wa UBR5 na PD-L1 unaosimamiwa na CRISPR/Cas9 una athari ya matibabu ya pamoja kuliko kizuizi chochote pekee, na athari kubwa kwenye mazingira madogo ya uvimbe (Wu et al., 2022). Kwa hivyo, CRISPR/Cas9 inaweza kuwa zana muhimu ya kuzuia utendaji kazi wa UBR5, na hivyo kukandamiza metastasis ya TNBC na ukuaji wa uvimbe.
ROR1 ni protini ya aina ya I transmembrane ambayo huonyeshwa wakati wa saratani na ukuaji wa kiinitete na imetambuliwa kama protini ya oncofetal (Nicholas Borcherding, 2014). Tabia vamizi ya saratani mbalimbali za binadamu inahusishwa na kuongezeka kwa ROR1. Matokeo mazuri yamepatikana kutoka kwa tafiti za ndani ya mwili na ndani ya vitro zinazohusisha misombo ya matibabu inayolenga ROR1 (Chien et al., 2016). Viwango vilivyoinuliwa vya mRNA ya ROR1 katika biopsy za tishu za matiti pia vimehusishwa na uvimbe mkali wa matiti (BL) unaofanana na basal na uhamiaji wao hadi sehemu zingine za mwili. Zaidi ya hayo, usemi kupita kiasi wa ROR1 umetambuliwa kama alama ya utabiri wa ukuaji wa TNBC (Chien et al., 2016). Hata hivyo, kunyamazisha ROR1 kwa kutumia CRISPR/Cas9 kukandamiza ukuaji wa TNBC na metastasis itakuwa mkakati mzuri.
Mchakato wa sialylation unahusisha kuongezwa kwa asidi ya sialic kwenye glycoconjugates, ambayo huchochewa na sialyltransferases (STs). ST8SIA1 ni ya familia ya ST na ina jukumu muhimu katika pathogenesis ya magonjwa mbalimbali kama vile leukemia ya limfositiki na saratani ya utumbo mpana (Chang et al., 2018). Uchambuzi wa mfuatano wa RNA unaonyesha kuwa ST8SIA1 inaonyeshwa sana katika tishu za matiti za wagonjwa wa TNBC na ina uhusiano mzuri na mabadiliko katika jeni la kukandamiza uvimbe p53, ambalo linaweza kuchangia pathogenesis ya TNBC (Battula et al., 2017). Kwa kuongezea, ST8SIA1 inahusika katika metastasis na kurudia kwa TNBC, ikidokeza kwamba ina jukumu muhimu katika kutokea na ukuaji wa TNBC. Katika mfumo wa TNBC wa ndani ya vitro, kuangushwa kwa ST8SIA1 na CRIPSR/Cas9 kulionyeshwa kuzuia ukuaji na metastasis (Battula et al., 2017). Hii inaonyesha kwamba CRISPR/Cas9 inaweza kuwa chombo muhimu cha kuzuia utendaji kazi wa onkojeni ya ST8SIA1 katika matibabu ya TNBC.
NAT1 ni kimeng'enya cha kimetaboliki kinachochochea uundaji wa misombo ya xenobiotic ya awamu ya II na huonyeshwa katika karibu tishu zote za binadamu. NAT1 inaweza kutumia folate ya cofactor kulenga acetyl-CoA (acetyl-CoA) hata bila substrate ya amino yenye harufu nzuri (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Uchunguzi umeonyesha kuwa NAT1 inadhibiti utendaji kazi wa metalloproteinase 9 (MMP9) katika mifumo ya seli za saratani ya matiti na inalinda dhidi ya spishi tendaji za oksijeni (ROS) wakati wa njaa ya glukosi (Wang et al., 2018). Kufutwa kwa NAT1 kumeonyeshwa kuzuia mchanganyiko wa pyruvate dehydrogenase, na kusababisha kutofanya kazi vizuri kwa mitochondrial (Wang L. et al., 2019). Zaidi ya hayo, ripoti zingine mbalimbali zimeonyesha kuwa kizuizi cha NAT1 kwa kutumia molekuli ndogo na kunyamazisha siRNA kunaweza kupunguza uvamizi na kuenea kwa seli za saratani ya matiti (Stepp et al., 2018). Hivi majuzi, CRISPR/Cas9 ilitumika kukandamiza NAT1 katika mstari wa seli za saratani ya matiti MDA-MB-231, na kuathiri kimetaboliki ya seli kulingana na kiwango chake cha usemi. Utafiti huu pia ulionyesha kuwa NAT-1 ni muhimu kwa maendeleo na metastasis ya TNBC (Carlisle et al., 2020).
Unukuzi ulioratibiwa wa onkojeni hudhibitiwa na viboreshaji bora, vipengele vya unukuzi na vipengele vya upatanishi (Hnisz et al., 2015). Zaidi ya hayo, kundi la kinasi zinazotegemea cyclin (CDKs), kama vile CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, na CDK13, zinahitajika kwa udhibiti wa unukuzi. Miongoni mwao, CDK7 inahusika katika fosforasi ya RNA polimerasi II, ambayo ni muhimu sana kwa kuanzisha na kupanua unukuzi wa onkojeni katika pathogenesis ya TNBC. Katika utafiti wa msingi, kufutwa kwa CDK7 na CRISPR/Cas9 kulizuia TNBC, ikionyesha kwamba pathogenesis ya TNBC inategemea CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Uchunguzi umeonyesha kuwa mabadiliko katika MYC na RBP (protini inayofunga RNA) yanaweza kusababisha apoptosis, huku mabadiliko ya jeni moja katika MYC au RBP hayaathiri ukuaji wa seli za saratani (Einstein et al., 2021). Zaidi ya RBP 1000 katika jenomu ya binadamu zimechunguzwa kwa kutumia maktaba yenye msingi wa CRISPR/Cas9. Miongoni mwao, RBP 57 ziligundulika kuwa muhimu kwa ukuaji wa seli za saratani zenye viwango vya juu vya MYC (Wheeler et al., 2020). Kwa kuongezea, YTHDF2 ni muhimu kwa kudumisha ukuaji wa seli za TNBC na hupunguza kiasi cha nakala zenye methili wakati wa unukuzi na tafsiri ya kiwango cha juu katika seli za saratani zenye usemi wa juu wa MYC. Zaidi ya hayo, YTHDF2 si muhimu kwa seli za saratani, ambazo hazitegemei sana viwango vya juu vya MYC ili kuongeza muda wa kuishi kwa wagonjwa wa TNBC (Einstein et al., 2021), ikidokeza kwamba inaweza kuwa lengo linalowezekana la matibabu kwa dawa zinazoweza kushinda TNBC.
Protini za vidole vya zinki (ZNFs) huunda takriban 1% ya jenomu yote ya binadamu. Uchunguzi umeonyesha kuwa ZNF inaweza kudhibiti kuongezeka kwa seli katika saratani mbalimbali, kama vile saratani ya ini, saratani ya matiti na saratani ya utumbo mpana (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Maktaba zinazozalishwa na CRISPR knockout zimetumika kuchunguza jeni mbalimbali za kuzuia uvimbe (TSGs) katika seli za saratani ya matiti (Shalem et al., 2014). Tangu wakati huo, utafiti wa transcriptomic wa seli za saratani ya matiti zilizofutwa na CRISPR/Cas9 ZNF319 umeonyesha kuwa ZNF319 ni jeni la kuzuia uvimbe ambalo hupunguza kuongezeka kwa saratani ya matiti na kwa hivyo linahusika katika mifumo mbalimbali ya ishara inayowezekana na kazi zingine za kibiolojia (Wang L. et al., 2022).
Ferroptosis ni aina ya kifo cha seli kilichopangwa ambacho kinategemea uwepo wa chuma. Inajulikana kuwa ukuaji wa ferroptosis huathiriwa na uwepo wa peroksidi za lipidi. Zaidi ya hayo, PKCβII imeripotiwa kuonyesha peroksidasi ya lipidi mapema, na ongezeko la peroksidasi ya lipidi linahusishwa na ferroptosis. Uchunguzi wa maktaba ya vizuizi vya kinasi vinavyosimamiwa na CRISPR/Cas9 ulionyesha kuwa PKCβII inahusika katika mchakato wa peroksidasi ya lipidi, ambayo ni muhimu kwa ferroptosis katika seli za MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Kwa hivyo, hii inaonyesha kwamba kutoweka kwa PKCβII na CRISPR/Cas9 kunaweza kuwa lengo la jeni la kukandamiza uvimbe kwa ajili ya matibabu ya magonjwa yanayohusiana na ferroptosis (Zhang et al., 2022).
Upinzani wa dawa unaaminika kuwajibika kwa takriban 90% ya vifo kwa wagonjwa wa saratani na ni mojawapo ya changamoto kubwa katika matibabu ya saratani (Bukowski et al., 2020). Matokeo yanaonyesha kwamba idadi ya kutosha ya jeni zinazohusiana na utokaji wa dawa, urekebishaji wa DNA, apoptosis na njia mbalimbali za kuashiria seli zinahusishwa na upinzani wa dawa (Haider et al., 2020). Miongoni mwao, jeni kadhaa zimelengwa na zana za CRISPR/Cas9 na zimeonyesha matokeo ya kuahidi katika kupunguza upinzani wa dawa na kuongeza ufanisi wa matibabu ya saratani (Vaghari-Tabari et al., 2022). Kwa kuongezea, maktaba za uchunguzi wa jeni za CRISPR/Cas9 zenye matokeo ya juu zimehusishwa katika kurekebisha utendaji kazi wa malengo ya jeni yanayoweza kuwa ya upinzani wa dawa (Shalem et al., 2015). Ili kutambua jeni za upinzani wa paclitaxel, mpangilio wa RNA pamoja na uchunguzi wa maktaba ya sgRNA ya jenomu nzima ulitumika kutambua jeni nane zinazohitajika, ikiwa ni pamoja na histone deacetylase 9 (HDAC9), ambazo zinahusishwa na upinzani wa dawa kwa wagonjwa walio na TNBC inayojirudia (B et al., 2020). ). Katika utafiti mwingine, ongezeko la usemi wa diserine/threonine na tyrosine protein kinase (DSTYK) lilionekana wakati wa kuishi kwa wagonjwa wa TNBC waliotibiwa na dawa za kupambana na saratani. Zaidi ya hayo, kushuka kwa DSTYK kwa CRISPR/Cas9 kuliongeza kwa kiasi kikubwa apoptosis ya seli za saratani zinazostahimili dawa ndani ya vitro (seli za SUM102PT na seli za MDA-MB-468) na modeli ya TNBC ndani ya vivo (Ogbu et al., 2021).
Ingawa TNBC ina uanzishaji usio wa kawaida wa njia ya MAPK, athari ya kimatibabu ya matibabu yanayolengwa na MEK ni duni. Uchunguzi wa maktaba ya jenomu ya CRISPR/Cas9 ulionyesha kuwa kizuizi cha PSMG2 (chaperone 2 ya mkusanyiko wa proteome) huhisisha seli za TNBC BT549 na MB468 kwa kizuizi cha MEK AZD6244. Kuanguka kwa PSMG2 kwa CRISPR/Cas9 kulibadilisha utendaji kazi wa kawaida wa proteasome, na kusababisha kutenganishwa kwa PDPK1 na autophagy, na hivyo kuboresha zaidi seli za uvimbe katika mifano ya panya wa TNBC inayosababishwa na AZD6244 (kizuizi cha MEK) na MG132 (kizuizi cha proteasome). Hivyo, vizuizi vya proteasome na MAP kinase (MEK) vinaweza kutolewa kwa ushirikiano ili kupunguza kuenea kwa seli za uvimbe (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 pia imetumika kuchunguza upotevu wa utendaji kazi wa jeni unaosababisha upinzani wa TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al. walielezea utaratibu wa upinzani wa dawa wa seli za saratani zilizotibiwa na JQ1, kizuizi cha BET bromodomain (BBDI), katika TNBC. Kwa kutumia CRISPR/Cas9, waligundua kuwa kufuta jeni la rb1 kulisababisha TNBC kuwa sugu kwa dawa ya kupambana na saratani JQ1. Kwa hivyo, utendaji kazi wa rb1 ni muhimu katika kukabiliana na dawa za JQ1 katika TNBC. Pia waliripoti kwamba paclitaxel ni kizuizi cha CDK4/6 kinase/microtubule, na mchanganyiko wake na BBDI kama vile JQ1 unaweza kutoa majibu ya matibabu yenye matumaini kwa TNBC sugu ya dawa (Ge et al., 2020).
Mazingira ya unukuzi wa RNA ndefu isiyo na usimbaji (lncRNA) yameripotiwa kuwajibika kwa upinzani dhidi ya tiba ya neoadjuvant katika TNBC. Utafiti huu unaonyesha kuwa nakala tano tofauti za MALAT1 lncRNA zinaonyeshwa sana katika TNBC. Zaidi ya hayo, ufutaji wa MALAT1 unaosababishwa na CRISPR/Cas9 uliongeza unyeti wa seli za TNBC BT-549 kwa paclitaxel na doxorubicin, ikidokeza jukumu linalowezekana la upinzani wa MALAT1 katika TNBC (Shaath et al., 2021).
Mabadiliko katika BRCA1 (BRCA1m) ni tofauti na kwa hivyo ni vigumu kugundua. Kulenga PARP1 (polimerasi ya poly(ADP-ribose)), mshirika hatari wa synthetic wa BRCA1, kunaweza kuongeza unyeti wa dawa za TNBC. Kwa kutumia CRISPR/Cas9, kufutwa kwa PARP1 kuliongeza unyeti wa dawa za kupambana na saratani kama vile doxorubicin, gemcitabine na docetaxel kwa seli za TNBC zenye mabadiliko ya mBRCA1, ikidokeza kwamba PARP1 pia inahusika katika upinzani wa dawa katika TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Mabadiliko katika jeni za kukandamiza uvimbe BRCA1 au BRCA2 yanajulikana kuongeza uwezekano wa kupata saratani ya matiti kwa watu. Matibabu ya wagonjwa hawa yanahitaji matumizi ya vizuizi vya PARP. Zaidi ya hayo, imeonyeshwa kuwa kufutwa kwa kipengele cha kuokoa nyukleotidi DNPH1 kwa kutumia CRISPR/Cas9 kunaweza kuondoa monophosphate yenye sumu ya nyukleotidi 5-hydroxymethyldeoxyuridine (hmdU), na hivyo kuongeza mwitikio wa seli zenye upungufu wa BRCA kwa unyeti kwa vizuizi vya PARP (Fugger). et al., 2021). Hivyo, vizuizi vya CRISPR/Cas9 na PARP1 vinaweza kuwa mkakati muhimu wa matibabu kwa TNBC.
Jeni la glycoproteini ya kupenya (P-gp) ni jeni la upinzani wa dawa nyingi ambalo kwa ujumla huongezeka katika takriban 41% ya TNBC zote (Sun et al., 2020). Kuondolewa kwa dawa inayosababishwa na P-gp kumetambuliwa kama kidhibiti muhimu cha upinzani wa dawa katika saratani ya matiti. Vizuizi vya P-gp vimeonyesha kuongezeka kwa unyeti kwa dawa za kupambana na saratani katika saratani ya matiti (Famta et al., 2021). Kwa hivyo, uondoaji au ukandamizaji wa vizuizi vya P-gp na P-gp unaosababishwa na CRISPR/Cas9 unaweza kuwa njia muhimu sana za kushinda upinzani wa dawa katika TNBC.
Kisafirisha kaseti kinachofunga ATP G2 (ABCG2) kinajulikana kusababisha upinzani wa dawa katika TNBC (Palasuberniam et al., 2015), ingawa kwa sasa hakuna ripoti kuhusu uhusiano kati ya CRISPR/Cas9 na kunyamazisha ABCG2 na kuzima jeni la kuzuia uvimbe. PTEN Inaweza kuongeza uanzishaji wa ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Kwa hivyo, kutumia CRISP/Ca9 kuondoa ABCG2 na kuichanganya na kizuizi cha ABCG2 inaweza kuwa matibabu yanayofaa ili kushinda upinzani wa dawa katika TNBC. Jedwali la 2 linataja CRISPR/Cas9 ikilenga jeni zote za upinzani.
Jedwali 2. CRISPR/Cas9 inalenga jeni mbalimbali za upinzani wa TNBC ili kuhisisha seli kwa dawa za kupambana na saratani.
Maktaba za CRISPR/Cas9 ni zana zinazowezekana za kuchunguza mabadiliko ya jeni yanayohusiana na pathogenesis ya saratani (Chan et al., 2022). Njia hii ya uchunguzi inahusisha hatua nne kama vile (a) ujenzi wa maktaba, (b) uhamishaji wa lentiviral, (c) uchunguzi wa phenotypic, na (d) uchambuzi wa jeni lengwa. Ingawa TNBC ina uanzishaji usio wa kawaida wa njia ya MAPK, ubashiri wa kimatibabu wa tiba inayolengwa na MEK kwa wagonjwa wa TNBC wanaobeba mabadiliko katika jeni za kuzuia uvimbe kama vile PTEN, RB1, na TP53 ni mbaya sana.
Zaidi ya hayo, uchunguzi wa jeni uliotumia CRISPR/Cas9 ulijaribu molekuli yenye nguvu na teule zaidi, dehydrocatrol, ambayo inapatikana kwa wingi katika dondoo za maua na majani za Guatemala, ili kuelewa athari ya dehydrocatrol kwenye MDA-MB-231. Utaratibu wa sumu ya seli teule. Sifa za shina za mesenchymal za aina ndogo za TNBC. Uchunguzi huu unaotegemea CRISPR/Cas9 pia ulifunua kwamba HSD17B11, jeni linalosimba 17β-hydroxysteroid dehydrogenase aina ya 11, linaonyeshwa sana katika seli za MDA-MB-231 na husababisha dehydrofalcarinol maalum kwa seli za MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). Kwa hivyo, hii inaonyesha kwamba uchunguzi wa jeni wa CRISPR/Cas9 una uwezo mkubwa katika kutambua mifumo iliyo chini ya sifa za kupambana na saratani za misombo asilia inayowezekana.
Kwa kuongezea, udhaifu wa TNBC kwa saratani ulisomwa kwa kutumia skrini ya CRISPR/Cas9 isiyo na upendeleo katika jenomu nzima ndani ya mwili, ambayo ilionyesha uhusiano kati ya njia za oncogenic na zinazokandamiza uvimbe. Vipengele muhimu vya njia za mTOR na Hippo vimeripotiwa kuchukua jukumu muhimu katika udhibiti wa uvimbe katika TNBC. Zaidi ya hayo, tafiti zimeonyesha kuwa kizuizi cha kifamasia cha mTORC1/2 na oncoprotein ya YAP huzuia kwa ufanisi uenezaji wa TNBC kwa kutumia modeli ya ushirikiano wa dawa-matrix ya ndani ya mwili na xenografti zinazotokana na mgonjwa ndani ya mwili. Zaidi ya hayo, kizuizi cha mTORC1/2 kinachosimamiwa na Torin-1 huongeza macropinocytosis, ilhali kizuizi cha YAP kinachosababishwa na vertebrofin husababisha kifo cha seli za TNBC. Kwa pamoja, matokeo haya yanaangazia nguvu na uimara wa uchunguzi wa CRISPR ndani ya mwili ili kutambua matibabu mapya na yenye ufanisi kwa TNBC (Dai et al., 2021).
Kuharibika kwa mfumo wa kinga ni jambo muhimu katika uundaji wa uvimbe. Seli za saratani huepuka uondoaji wa kinga kwa kukwepa mifumo ya ulinzi, ikiwa ni pamoja na kuingilia shughuli za seli za kinga katika mazingira madogo ya uvimbe na kuathiri mfumo wa kinga. Kwa hivyo, kukuza mfumo bora wa kinga inaweza kuwa njia muhimu ya kupambana na uvimbe. Matumizi ya marekebisho ya jeni yanayotegemea CRISPR/Cas9 yanashughulikia masuala kadhaa yanayohusiana na utendakazi mbaya wa kinga kutoka mitazamo tofauti. CRISPR/Cas9 imetumika kuboresha kinga ya kupambana na uvimbe dhidi ya saratani ya matiti kupitia njia zifuatazo (Mchoro 3).
Mchoro 3. Tiba ya kinga ya CRISPR/Cas9 inalenga seli za TNBC. Kupotea kwa CDK5 na kushuka kwa PDL1 na CD155 huongeza mfumo wa kinga. Vile vile, kushuka kwa A2AR na kushuka kwa TAA kama vile HER2, mucin 1 na TEM8 kuliongeza ufanisi wa seli za CAR-T katika kuua seli za saratani. Uchunguzi wa seli za T unaoendeshwa na CRISPR/Cas9 umeonyesha kuwa kuvurugika kwa kinase ya p38 huongeza shughuli za seli za T za kuzuia uvimbe. Seli za T zilizobadilishwa na CRISPR/Cas9 huongeza usemi wa TCR (kipokezi cha seli za T), na kusababisha seli za T kuwa na shughuli za kuzuia uvimbe.
Lengo la tiba ya kinga mwilini ni kuchochea mfumo wa kinga kushambulia seli za saratani. Uzito kupita kiasi wa protini za kinga mwilini kwa kawaida huzuia athari za kinga mwilini lakini unaweza kusaidia saratani kuziepuka (Topalian et al., 2015). Protini hizi huzuia athari za kinga mwilini kwa kujifunga kwenye vipokezi kwenye uso wa seli za kinga mwilini. Protini nyingi za sehemu ya ukaguzi (kama vile CD155 na PD-L1) hulenga kipokezi cha PD-1 kwenye seli za kinga mwilini na huonyeshwa katika saratani ya matiti, hasa TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Kupunguza PD-L1 au kipokezi chake kwa kutumia CRISPR/Cas9 kunaweza kuchochea mfumo wa kinga kushambulia uvimbe wa TNBC (Yahata et al., 2019). Zaidi ya hayo, kupunguza usemi wa PD-L1 kupitia uondoaji wa CDK5 unaosababishwa na CRISPR/Cas9 kumeonyeshwa kuzuia ukuaji wa uvimbe ndani ya mwili na ndani ya mwili (Deng et al., 2020). Kizuizi cha ukuaji katika mifano ya saratani ya matiti ndani ya vitro na ndani ya mwili kinaonyesha kwamba kupungua kwa CD155 kunakosababishwa na shRNA kunaweza kuwa na athari ya matibabu kwenye saratani ya matiti (Gao et al., 2018).
Seli za CAR T huonyesha CAR zinazotambua antijeni zinazohusiana na uvimbe (TAAs) na zinaweza kutumia kushuka kwa protini za checkpoint ili kuongeza shughuli zao (Li C. et al., 2020). Kuna malengo mbalimbali yanayowezekana ya tiba ya seli za CAR T katika saratani ya matiti, ikiwa ni pamoja na TAA kadhaa kama vile HER2, mucin1, na TEM8 (Bajgain et al., 2018). Kuna ushahidi kwamba seli za CAR T zinazolenga mesothelin (iliyotolewa kupita kiasi katika seli za TNBC BT-459) zinafaa zaidi dhidi ya saratani wakati PD-1 inapoondolewa kwa kutumia CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Hata hivyo, kutenga seli za T kutoka kwa wagonjwa na kisha kuzihariri ex vivo ni mchakato unaohitaji kazi nyingi na unaochukua muda mwingi. Ingawa seli za T za ulimwengu wote zinaweza kupunguza mahitaji ya kutengwa, seli za T zinazotoa antijeni ya leukocyte ya binadamu (HLA) darasa la I na kipokezi cha seli za T (TCR) zinapaswa kuondolewa ili kuzuia kasoro za kipandikizi dhidi ya mwenyeji (Ren et al., 2017). , 2017a). Kwa kutumia CRISPR/Cas9, HDR inaweza kuondoa TCR na HLA kwa wakati mmoja na kuondoa jeni linalosimba CAR. Uchunguzi umeonyesha kuwa CRISPR/Cas9 inaweza kutumika kuingiza CAR zinazopinga CD19 kwenye eneo la TCR, na hivyo kutoa CAR kwa ufanisi bila kuharibu seli T (Dimitri et al., 2022). Teknolojia za Multiplex zimetengenezwa ili kutoa seli T za CAR zinazoitwa allogeneic kwa kuondoa TCR, beta-2-microglobulin (B2M), kitengo kidogo cha HLA-I na protini zingine kama vile PD-1 na CTLA-4, ambazo zinaweza kuwa na sifa kubwa za kupambana na saratani dhidi ya TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Kutumia CRISPR/Cas9 kunaweza kuboresha ufanisi wa seli za CAR-T. Adenosine inajulikana kuwa na sifa za kukandamiza kinga na inaweza kupunguza kinga ya saratani kwa kuzuia utendaji kazi wa seli T na kuamsha vipokezi vya adenosine A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). Kunyamazisha A2AR kwa kutumia CRISPR/Cas9 kuliboresha kwa kiasi kikubwa ufanisi wa seli za CAR-T mwilini (Giuffrida et al., 2021). Seli T zinajulikana kuonyesha sifa mbalimbali za phenotypic kama vile upanuzi wa seli, utofautishaji, msongo wa oksidi na msongo wa kijenetiki. Uchunguzi wa seli T unaotegemea CRISPR/Cas9 ulionyesha usumbufu wa kinasi 25 tofauti za vipokezi vya seli T. Miongoni mwao, kufutwa kwa kinasi ya p38 kumeonyeshwa kuongeza shughuli ya kupambana na uvimbe wa seli T, ikionyesha kwamba kinasi ya p38 ni mdhibiti muhimu wa udhibiti wa seli CAR-T (Gurasamy et al., 2020).
Seli T zinaweza kubadilishwa vinasaba kwa kutumia CRISPR/Cas9 ili kutoa TCR zilizo na kiwango cha juu cha ukali. Kuhamisha seli T zilizobadilishwa vinasaba kwa wagonjwa kumeonyesha shughuli kubwa ya kupambana na saratani kuliko seli T za asili. Kwa hivyo, TCR za asili zinaweza kushindana na TCR zilizobadilishwa vinasaba kwa wagonjwa, ambayo inaweza kuathiri uwezo wa tiba ya kinga ya saratani. Ili kushinda tatizo hili, kutumia CRISPR/Cas9 kuondoa TCR-β ya asili katika seli za mpokeaji na baadaye kuhamisha seli T za TCR-β kwa wagonjwa wa saratani kunaweza kuonyesha majibu bora ya kinga dhidi ya saratani bila hitaji la ushindani wa kijinsia wa TCR ya asili (Fan et al. 2018). Kwa hivyo, isipokuwa seli T zilizobadilishwa na CRISPR, TCR zina unyeti mara elfu zaidi kwa antijeni za uvimbe kuliko seli T za kawaida zilizobadilishwa na TCR. Zaidi ya hayo, katika leukemia mbalimbali, seli T zilizobadilishwa zinazozalishwa na γδ TCR+ CRISPR zinaonyesha usemi wa juu wa seli T za CD4+ na CD8+ kuliko uhamishaji wa kawaida wa TCR (Legut et al., 2018). Kwa hivyo, seli T zilizobadilishwa zinazozalishwa na CRISPR/Cas9 zinaweza kuwa njia bora ya tiba ya kinga mwilini ili kushinda TNBC.
Integrins ni molekuli za kushikamana kwa seli ambazo zipo katika utando wa seli na huendeleza kufungamana kwa seli kwenye matrix ya nje ya seli (ECM) (Hamidi na Ivaska, 2018). Uharibifu wa integrins unahusishwa na ukuaji na uhamiaji wa saratani kwa kubadilisha matrix ya nje ya seli, na kusababisha uhai wa seli za saratani katika mzunguko wa damu (Hamidi na Ivaska, 2018). Kushuka kwa integrin inayosimamiwa na CRISPR/Cas9 hupunguza kasi ya ukuaji wa uvimbe, metastasis, na ukoloni katika TNBC. Kushuka kwa integrin a5 (ITGA5) kumeripotiwa kupunguza uhamiaji wa seli na kuendelea katika saratani zingine kama vile saratani ya mapafu (Ju et al., 2017), ikidokeza kwamba integrin a5 inaweza pia kuwa sababu muhimu katika pathogenesis ya TNBC.
Kuzalisha panya wa kugonga kwa kutumia mbinu za seli za shina za kiinitete (ES) za kitamaduni ni mchakato unaohitaji kazi nyingi, unaochukua muda mwingi, na usio na ufanisi. Inachukua miezi na miaka kulenga seli za ES kupitia uunganishaji wa homologous, kuzaliana panya wa chimeric, na kisha kuzichanganya na panya wa heterozygous ili kuzalisha watoto wa homozygous. Uzazi tata wa mseto unahitajika ili kuunda panya wenye mabadiliko mengi ya kijenetiki. Hata hivyo, matatizo mengi yametokea wakati wa kutumia panya wanaotokana na kuondolewa kwa seli za ES kwa kutumia CRISPR/Cas9 au kwa kuingiza vipengele vya CRISPR/Cas9 kwenye mayai yenye mbolea ya seli moja. Kwa mfano, kuanzishwa kwa mabadiliko mara nyingi hutokea kwenye loci ya bialli na si maalum kwa jeni. Hivi majuzi iliripotiwa kwamba seli za ES zinazotumia teknolojia ya CRISPR/Cas9 zinaweza kuingiza mabadiliko ya bialli katika hadi jeni 5 kwa wakati mmoja (Nishizono et al., 2021). Kwa kusudi hili, mRNA ya Cas9 na gRNA tano maalum kwa jeni zilihamishiwa kwa wakati mmoja kwenye seli za ES. Hii inaangazia ahadi na ufanisi wa utaratibu huu, ingawa mabadiliko haya yanaweza kuwa yalipitishwa wakati mistari ya mwanzilishi ilipozalishwa ili kutoa panya watano wa kugonga. Utafiti pia unaripoti ugunduzi wa kushangaza: Seli za ES hazihitajiki tena kuunda panya waliobadilishwa vinasaba. Badala yake, ili kuondoa bidhaa maalum za jeni, mRNA ya Cas9 na gRNA ziliingizwa kwenye viinitete vya hatua ya seli moja. Matokeo yake, mistari ya mwanzilishi wa kugonga imeundwa ambayo inaweza kutumika kinadharia kusoma matokeo ya kufutwa kwa jeni kwa panya (Qin et al., 2016). Kwa hivyo, CRISPR/Cas9 inaruhusu uundaji wa panya waliobadilishwa jeni kutibu TNBC kwa gharama ya chini kuliko uhandisi wa jeni wa jadi. Kwa kutumia mfumo wa CRISPR/Cas, modeli mpya ya panya wa kugonga imetengenezwa ambayo inaweza kuanzisha mabadiliko ya nukta katika jeni moja au zaidi za asili katika TNBC. Kulingana na dhana hii, mifano ya wanyama ya TNBC inaweza pia kutengenezwa kwa kutumia ufutaji wa BRCA1 na p53 unaosababishwa na CRISPR/Cas9, na kusababisha upotevu wa ukarabati wa HR, kutokuwa na utulivu wa kijenomu, na fenotipu zilizobadilika (Annunziato et al., 2020).
Hivi sasa, mbinu mbalimbali kama vile mammografia, upigaji picha wa mwangwi wa sumaku (MRI) na ultrasound hutumika kugundua TNBC. Hata hivyo, njia hizi zina mapungufu fulani. Mammografia hutumika kugundua tishu za matiti za ndani badala ya metastases, ambapo seli za saratani zimehamia kwenye viungo vingine. Ultrasonografia si njia ya kuaminika ya kugundua TNBC (Chen na Lee-Felker, 2023). MRI ina unyeti mkubwa kuliko ultrasound na mammografia, lakini usahihi wake wa utambuzi ni mdogo (Sha na Chen, 2022). Biopsy ya tishu ni njia vamizi ya kutambua seli za saratani. Hata hivyo, katika baadhi ya matukio, biopsy inaweza kukosa tishu za saratani ikiwa sindano itapotea kutoka eneo la kuvutia. Kwa kuongezea, ni ghali sana na inaweza kuwa kiwewe kwa mgonjwa. TNBC ni aina tofauti ya saratani, kwa hivyo biopsy inaweza isitoe taarifa za kutosha kuhusu aina ya saratani. Kwa hivyo, njia mpya ya kuaminika ya kugundua TNBC inahitajika haraka. CRISPR/Cas9 inaweza kutumika kama njia mbadala nyeti sana na isiyovamia sana kwa utambuzi wa saratani ya matiti. Kwa lengo hili, mikakati inayotegemea CRISPR/Cas9 inaweza kutumika kuboresha mbinu za PCR kwa ajili ya utambuzi wa TNBC. Kwanza, protini za Cas9 na cpf1 za mfumo wa CRISPR hutumika kuondoa DNA isiyo maalum, na kisha protini hizi mbili (Cas9 na cpf1) zinaweza kutambua mfuatano wa PAM kabla ya kuunganishwa na DNA lengwa (Deepak Singh et al., 2021). . Kwa hivyo, PCR inaweza kutambua mabadiliko yanayohusiana na ukuaji wa saratani. Tafiti kadhaa zimepitisha mkakati huu unaotegemea CRISPR ili kugundua mabadiliko tofauti katika saratani tofauti (Safari et al., 2019). Kwa hivyo, mbinu za PCR zinazotegemea CRISPR zinaweza kupunguza utegemezi wa utambuzi wa TNBC kwenye mbinu vamizi kama vile immunohistochemistry inayotegemea biopsy.
Mabadiliko ya kijeni katika udhibiti wa vipokezi vya homoni pia yameonyeshwa katika TNBC (Chen na Russo, 2009). Mikakati ya PCR inayotegemea CRISPR/Cas9 inayotumia microarrays kwa ajili ya uchunguzi wa vituo vya utunzaji inaweza kufuatilia kwa ufanisi mabadiliko haya (Hajian et al., 2019). Inaweza pia kuwapa watoa huduma za afya taarifa muhimu kuhusu mabadiliko maalum kwa wagonjwa wa TNBC, ambayo inaweza kusaidia kuboresha kozi yao ya matibabu. Hata hivyo, mbinu hii ya pamoja ina mapungufu. Kwa hivyo, juhudi kubwa za utafiti zinahitajika kabla ya njia hii ya CRISPR/Cas-PCR kutumika katika huduma ya afya kwa ajili ya utambuzi wa TNBC (Yang et al., 2019).