Utambuzi tofauti wa vinundu vya mapafu vilivyotambuliwa kwa kutumia tomografia iliyokadiriwa (CT) bado ni changamoto katika mazoezi ya kliniki. Hapa, tunaainisha metabolomu ya kimataifa ya sampuli 480 za seramu, ikiwa ni pamoja na vidhibiti vyenye afya, vinundu vya mapafu visivyo na madhara, na adenocarcinoma ya mapafu ya hatua ya I. Adenocarcinomas huonyesha wasifu wa kipekee wa metabolomu, ilhali vinundu visivyo na madhara na watu wenye afya njema wana kufanana sana katika wasifu wa metabolomu. Katika kundi la ugunduzi (n = 306), seti ya metaboliti 27 ilitambuliwa ili kutofautisha kati ya vinundu visivyo na madhara na vibaya. AUC ya modeli ya ubaguzi katika uthibitishaji wa ndani (n = 104) na uthibitishaji wa nje (n = 111) ilikuwa 0.915 na 0.945, mtawalia. Uchambuzi wa njia ulibaini kuongezeka kwa metaboliti za glycolytic zinazohusiana na kupungua kwa tryptophan katika seramu ya adenocarcinoma ya mapafu ikilinganishwa na vinundu visivyo na madhara na vidhibiti vyenye afya, na ilipendekeza kwamba ufyonzaji wa tryptophan hukuza glycolysis katika seli za saratani ya mapafu. Utafiti wetu unaangazia thamani ya viashiria vya metaboliti katika seramu katika kutathmini hatari ya vinundu vya mapafu kugunduliwa na CT.
Utambuzi wa mapema ni muhimu ili kuboresha viwango vya kuishi kwa wagonjwa wa saratani. Matokeo kutoka Jaribio la Kitaifa la Uchunguzi wa Saratani ya Mapafu la Marekani (NLST) na Utafiti wa NELSON wa Ulaya yameonyesha kuwa uchunguzi kwa kutumia kipimo cha chini cha tomografia iliyokadiriwa (LDCT) unaweza kupunguza kwa kiasi kikubwa vifo vya saratani ya mapafu katika makundi yaliyo katika hatari kubwa1,2,3. Tangu matumizi makubwa ya LDCT kwa uchunguzi wa saratani ya mapafu, matukio ya matokeo ya radiografia ya ghafla ya vinundu vya mapafu visivyo na dalili yameendelea kuongezeka 4. Vinundu vya mapafu hufafanuliwa kama viwazi vya focal hadi kipenyo cha 3 cm 5. Tunakabiliwa na ugumu katika kutathmini uwezekano wa uvimbe mbaya na kushughulikia idadi kubwa ya vinundu vya mapafu vilivyogunduliwa kwa bahati mbaya kwenye LDCT. Mapungufu ya CT yanaweza kusababisha uchunguzi wa mara kwa mara wa ufuatiliaji na matokeo chanya ya uwongo, na kusababisha uingiliaji kati usio wa lazima na matibabu ya kupita kiasi6. Kwa hivyo, kuna haja ya kutengeneza alama za kibiolojia zinazoaminika na muhimu ili kutambua kwa usahihi saratani ya mapafu katika hatua za mwanzo na kutofautisha vinundu vingi visivyo na madhara wakati wa kugundua kwa mara ya kwanza 7.
Uchambuzi kamili wa molekuli wa damu (seramu, plasma, seli za mononuklia za damu za pembeni), ikiwa ni pamoja na jenomu, proteomics au methylation ya DNA8,9,10, umesababisha kuongezeka kwa shauku katika ugunduzi wa alama za kibayolojia za utambuzi wa saratani ya mapafu. Wakati huo huo, mbinu za metabolomiki hupima bidhaa za mwisho za seli ambazo huathiriwa na vitendo vya ndani na vya nje na kwa hivyo hutumika kutabiri mwanzo na matokeo ya ugonjwa. Spektrometri ya umati wa chromatografia ya kioevu-sanjari (LC-MS) ni njia inayotumika sana kwa masomo ya metabolomiki kutokana na unyeti wake wa juu na anuwai kubwa ya nguvu, ambayo inaweza kufunika metaboliti zenye sifa tofauti za kifizikia11,12,13. Ingawa uchambuzi wa kimetaboliki wa kimataifa wa plasma/seramu umetumika kutambua alama za kibayolojia zinazohusiana na utambuzi wa saratani ya mapafu14,15,16,17 na ufanisi wa matibabu, viainishaji 18 vya metaboliti vya seramu ili kutofautisha kati ya vinundu vya mapafu visivyo na madhara na vibaya bado vinasomwa sana. -utafiti mkubwa.
Adenocarcinoma na saratani ya seli squamous ndizo aina mbili kuu za saratani ya mapafu isiyo ya seli ndogo (NSCLC). Vipimo mbalimbali vya uchunguzi wa CT vinaonyesha kuwa adenocarcinoma ndiyo aina ya kawaida ya histological ya saratani ya mapafu1,19,20,21. Katika utafiti huu, tulitumia ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) kufanya uchambuzi wa metabolomiki kwenye jumla ya sampuli 695 za seramu, ikiwa ni pamoja na vidhibiti vyenye afya, vinundu vya mapafu visivyo na madhara, na CT-detected ≤3 cm. Uchunguzi wa adenocarcinoma ya mapafu ya Hatua ya I. Tulitambua jopo la metaboliti za seramu zinazotofautisha adenocarcinoma ya mapafu na vinundu visivyo na madhara na vidhibiti vyenye afya. Uchambuzi wa uboreshaji wa njia ulibaini kuwa tryptophan isiyo ya kawaida na kimetaboliki ya glukosi ni mabadiliko ya kawaida katika adenocarcinoma ya mapafu ikilinganishwa na vinundu visivyo na madhara na vidhibiti vyenye afya. Hatimaye, tulianzisha na kuthibitisha uainishaji wa kimetaboliki katika seramu wenye umaalum na unyeti wa hali ya juu ili kutofautisha kati ya vinundu vya mapafu vyenye madhara na visivyo na madhara vinavyogunduliwa na LDCT, ambavyo vinaweza kusaidia katika utambuzi wa awali na tathmini ya hatari.
Katika utafiti wa sasa, sampuli za seramu zinazolingana na jinsia na umri zilikusanywa kwa kurudi nyuma kutoka kwa vidhibiti 174 vyenye afya, wagonjwa 292 wenye vinundu visivyo na madhara vya mapafu, na wagonjwa 229 wenye adenocarcinoma ya mapafu ya hatua ya I. Sifa za idadi ya watu 695 zimeonyeshwa katika Jedwali la Ziada 1.
Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 1a, jumla ya sampuli 480 za seramu, ikiwa ni pamoja na sampuli 174 za udhibiti bora (HC), nodules 170 zisizo na madhara (BN), na sampuli 136 za adenocarcinoma ya mapafu ya hatua ya I, zilikusanywa katika Kituo cha Saratani cha Chuo Kikuu cha Sun Yat-sen. Kundi la ugunduzi wa wasifu wa kimetaboliki usiolengwa kwa kutumia chromatografia ya kioevu yenye utendaji wa hali ya juu-spectrometry ya umati (UPLC-HRMS). Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro wa Nyongeza 1, metaboliti tofauti kati ya LA na HC, LA na BN zilitambuliwa ili kuanzisha mfumo wa uainishaji na kuchunguza zaidi uchambuzi wa njia tofauti. Sampuli 104 zilizokusanywa na Kituo cha Saratani cha Chuo Kikuu cha Sun Yat-sen na sampuli 111 zilizokusanywa na hospitali zingine mbili zilifanyiwa uthibitishaji wa ndani na nje, mtawalia.
a Idadi ya watu waliosoma katika kundi la ugunduzi waliopitia uchambuzi wa metabolomiki za seramu duniani kwa kutumia ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS). b Uchambuzi wa ubaguzi wa miraba midogo kidogo (PLS-DA) wa jumla ya metabolomu ya sampuli 480 za seramu kutoka kundi la utafiti, ikijumuisha vidhibiti vyenye afya (HC, n = 174), vinundu visivyo na madhara (BN, n = 170), na adenocarcinoma ya mapafu ya hatua ya I (Los Angeles, n = 136). +ESI, hali ya ioni ya electrospray chanya, -ESI, hali ya ioni ya electrospray hasi. c–e Metabolites zenye wingi tofauti sana katika makundi mawili yaliyotolewa (jaribio la cheo lililosainiwa na Wilcoxon lenye mikia miwili, thamani ya p iliyorekebishwa ya kiwango cha ugunduzi bandia, FDR <0.05) zinaonyeshwa kwa rangi nyekundu (mabadiliko ya mara > 1.2) na bluu (mabadiliko ya mara < 0.83). ) zinazoonyeshwa kwenye mchoro wa volkano. Ramani ya joto ya msongamano wa kihierarkia inayoonyesha tofauti kubwa katika idadi ya metaboliti zilizofafanuliwa kati ya LA na BN. Data chanzo hutolewa katika mfumo wa faili za data chanzo.
Jumla ya metaboli ya seramu ya 174 HC, 170 BN na 136 LA katika kundi la ugunduzi ilichambuliwa kwa kutumia uchanganuzi wa UPLC-HRMS. Kwanza tunaonyesha kwamba sampuli za udhibiti wa ubora (QC) hukusanyika kwa uthabiti katikati ya modeli ya uchanganuzi mkuu wa vipengele (PCA) usiosimamiwa, ikithibitisha uthabiti wa utendaji wa utafiti wa sasa (Mchoro wa Nyongeza 2).
Kama inavyoonyeshwa katika uchanganuzi wa ubaguzi mdogo wa miraba (PLS-DA) katika Mchoro 1 b, tuligundua kuwa kulikuwa na tofauti dhahiri kati ya LA na BN, LA na HC katika hali chanya (+ESI) na hasi (−ESI) za ioni zilizotengwa. Hata hivyo, hakuna tofauti kubwa zilizopatikana kati ya BN na HC katika hali ya +ESI na -ESI.
Tulipata vipengele 382 vya tofauti kati ya LA na HC, vipengele 231 vya tofauti kati ya LA na BN, na vipengele 95 vya tofauti kati ya BN na HC (mtihani wa cheo uliosainiwa na Wilcoxon, FDR <0.05 na mabadiliko mengi >1.2 au <0.83) (Mchoro .1c-e). . Vilele vilifafanuliwa zaidi (Data ya Nyongeza 3) dhidi ya hifadhidata (maktaba ya mzCloud/HMDB/Chemspider) kwa thamani ya m/z, muda wa uhifadhi na utafutaji wa wigo wa wingi wa kugawanyika (maelezo yaliyoelezwa katika sehemu ya Mbinu) 22. Hatimaye, metaboliti 33 na 38 zilizofafanuliwa zenye tofauti kubwa za wingi zilitambuliwa kwa LA dhidi ya BN (Mchoro 1f na Jedwali la Nyongeza 2) na LA dhidi ya HC (Mchoro wa Nyongeza 3 na Jedwali la Nyongeza 2), mtawalia. Kwa upande mwingine, metaboliti 3 pekee zenye tofauti kubwa katika wingi zilitambuliwa katika BN na HC (Jedwali la Nyongeza 2), sambamba na mwingiliano kati ya BN na HC katika PLS-DA. Metaboliti hizi tofauti hufunika aina mbalimbali za kibiokemikali (Mchoro wa Nyongeza 4). Kwa pamoja, matokeo haya yanaonyesha mabadiliko makubwa katika metaboliti ya seramu ambayo yanaonyesha mabadiliko mabaya ya saratani ya mapafu ya hatua ya mwanzo ikilinganishwa na vinundu vya mapafu visivyo na madhara au watu wenye afya njema. Wakati huo huo, kufanana kwa metaboliti ya seramu ya BN na HC kunaonyesha kwamba vinundu visivyo na madhara vya mapafu vinaweza kushiriki sifa nyingi za kibiolojia na watu wenye afya njema. Kwa kuzingatia kwamba mabadiliko ya jeni ya kipokezi cha ukuaji wa seli za ngozi (EGFR) ni ya kawaida katika aina ndogo ya 23 ya adenocarcinoma ya mapafu, tulitaka kubaini athari za mabadiliko ya kichocheo kwenye metaboliti ya seramu. Kisha tukachambua wasifu wa jumla wa metaboliti wa visa 72 vyenye hali ya EGFR katika kundi la adenocarcinoma ya mapafu. Cha kufurahisha ni kwamba, tulipata wasifu unaofanana kati ya wagonjwa waliobadilika wa EGFR (n = 41) na wagonjwa wa aina ya porini wa EGFR (n = 31) katika uchanganuzi wa PCA (Mchoro wa Nyongeza 5a). Hata hivyo, tulitambua metaboliti 7 ambazo wingi wake ulibadilika kwa kiasi kikubwa kwa wagonjwa walio na mabadiliko ya EGFR ikilinganishwa na wagonjwa walio na EGFR ya aina ya porini (t test, p < 0.05 na fold change > 1.2 au < 0.83) (Mchoro wa Nyongeza 5b). Mengi ya metaboliti hizi (5 kati ya 7) ni acylcarnitines, ambazo zina jukumu muhimu katika njia za oksidishaji ya asidi ya mafuta.
Kama inavyoonyeshwa katika mtiririko wa kazi unaoonyeshwa kwenye Mchoro 2 a, alama za kibiolojia za uainishaji wa nodule zilipatikana kwa kutumia viendeshaji vya kushuka kabisa na uteuzi kulingana na metaboliti 33 tofauti zilizotambuliwa katika LA (n = 136) na BN (n = 170). Mchanganyiko bora wa vigezo (LASSO) - modeli ya urekebishaji wa vifaa vya binary. Uthibitisho mtambuka wa mara kumi ulitumika kujaribu uaminifu wa modeli. Uteuzi unaobadilika na urekebishaji wa vigezo hurekebishwa kwa adhabu ya kuongeza uwezekano na parameter λ24. Uchambuzi wa metabolomiki wa kimataifa ulifanywa zaidi kwa kujitegemea katika vikundi vya uthibitisho wa ndani (n = 104) na uthibitisho wa nje (n = 111) ili kujaribu utendaji wa uainishaji wa modeli ya ubaguzi. Matokeo yake, metaboliti 27 katika seti ya ugunduzi zilitambuliwa kama modeli bora ya ubaguzi yenye thamani kubwa zaidi ya wastani ya AUC (Mchoro 2b), kati ya hizo 9 zilikuwa na shughuli iliyoongezeka na shughuli 18 zilizopungua katika LA ikilinganishwa na BN (Mchoro 2c).
Mtiririko wa kazi wa kujenga kiainishaji cha vinundu vya mapafu, ikiwa ni pamoja na kuchagua paneli bora ya metaboliti za seramu katika seti ya ugunduzi kwa kutumia modeli ya urejeshaji wa vifaa vya binary kupitia uthibitishaji mtambuka mara kumi na kutathmini utendaji wa utabiri katika seti za uthibitishaji wa ndani na nje. b Takwimu za uthibitishaji mtambuka wa modeli ya urejeshaji ya LASSO kwa uteuzi wa biomarker ya kimetaboliki. Nambari zilizotolewa hapo juu zinawakilisha idadi ya wastani ya biomarker zilizochaguliwa katika λ iliyotolewa. Mstari mwekundu wenye nukta unawakilisha wastani wa thamani ya AUC katika lambda inayolingana. Baa za hitilafu za kijivu zinawakilisha thamani za chini na za juu za AUC. Mstari wenye nukta unaonyesha modeli bora yenye biomarker 27 zilizochaguliwa. AUC, eneo chini ya mkunjo wa sifa ya uendeshaji wa mpokeaji (ROC). c Mabadiliko ya mara ya metaboliti 27 zilizochaguliwa katika kundi la LA ikilinganishwa na kundi la BN katika kundi la ugunduzi. Safu wima nyekundu - uanzishaji. Safu wima ya bluu ni kupungua. d–f Mikunjo ya sifa ya uendeshaji wa mpokeaji (ROC) inayoonyesha nguvu ya modeli ya ubaguzi kulingana na michanganyiko 27 ya metaboliti katika seti za uthibitishaji wa ugunduzi, wa ndani, na wa nje. Data chanzo hutolewa katika mfumo wa faili za data chanzo.
Mfano wa utabiri uliundwa kulingana na vigezo vya urejeshaji vilivyopimwa vya metaboli hizi 27 (Jedwali la Nyongeza 3). Uchambuzi wa ROC kulingana na metaboli hizi 27 ulitoa eneo chini ya thamani ya mkunjo (AUC) wa 0.933, unyeti wa kikundi cha ugunduzi ulikuwa 0.868, na umahususi ulikuwa 0.859 (Mchoro 2d). Wakati huo huo, miongoni mwa metaboli 38 tofauti zilizofafanuliwa kati ya LA na HC, seti ya metaboli 16 ilipata AUC ya 0.902 ikiwa na unyeti wa 0.801 na umahususi wa 0.856 katika kutofautisha LA kutoka HC (Mchoro wa Nyongeza 6a-c). Thamani za AUC kulingana na vizingiti tofauti vya mabadiliko ya mkunjo kwa metaboli tofauti pia zililinganishwa. Tuligundua kuwa mfumo wa uainishaji ulifanya vyema zaidi katika kutofautisha kati ya LA na BN (HC) wakati kiwango cha mabadiliko ya mkunjo kiliwekwa kuwa 1.2 dhidi ya 1.5 au 2.0 (Mchoro wa Nyongeza 7a,b). Mfano wa uainishaji, kulingana na vikundi 27 vya kimetaboliki, ulithibitishwa zaidi katika vikundi vya ndani na nje. AUC ilikuwa 0.915 (unyeti 0.867, umaalumu 0.811) kwa uthibitisho wa ndani na 0.945 (unyeti 0.810, umaalumu 0.979) kwa uthibitisho wa nje (Mchoro 2e, f). Ili kutathmini ufanisi wa maabara, sampuli 40 kutoka kwa kikundi cha nje zilichambuliwa katika maabara ya nje kama ilivyoelezwa katika sehemu ya Mbinu. Usahihi wa uainishaji ulifikia AUC ya 0.925 (Mchoro wa Nyongeza 8). Kwa sababu saratani ya seli ya squamous ya mapafu (LUSC) ndiyo aina ya pili ya kawaida ya saratani ya mapafu isiyo ya seli ndogo (NSCLC) baada ya adenocarcinoma ya mapafu (LUAD), pia tulijaribu matumizi yaliyothibitishwa ya wasifu wa kimetaboliki. BN na visa 16 vya LUSC. AUC ya ubaguzi kati ya LUSC na BN ilikuwa 0.776 (Mchoro wa Nyongeza 9), ikionyesha uwezo duni ikilinganishwa na ubaguzi kati ya LUAD na BN.
Uchunguzi umeonyesha kuwa ukubwa wa vinundu kwenye picha za CT una uhusiano mzuri na uwezekano wa uvimbe na unabaki kuwa kigezo kikuu cha matibabu ya vinundu25,26,27. Uchambuzi wa data kutoka kwa kundi kubwa la utafiti wa uchunguzi wa NELSON ulionyesha kuwa hatari ya uvimbe kwa watu wenye nodi <5 mm ilikuwa sawa na ile kwa watu wasio na nodi 28. Kwa hivyo, ukubwa wa chini unaohitaji ufuatiliaji wa kawaida wa CT ni 5 mm, kama ilivyopendekezwa na Jumuiya ya Kifua cha Uingereza (BTS), na 6 mm, kama ilivyopendekezwa na Jumuiya ya Fleischner 29. Hata hivyo, vinundu vikubwa kuliko 6 mm na bila sifa dhahiri zisizo na madhara, zinazoitwa vinundu vya mapafu visivyojulikana (IPN), vinabaki kuwa changamoto kubwa katika tathmini na usimamizi katika mazoezi ya kliniki30,31. Tulichunguza baadaye ikiwa ukubwa wa vinundu uliathiri sahihi za metabolomiki kwa kutumia sampuli zilizounganishwa kutoka kwa makundi ya ugunduzi na uthibitisho wa ndani. Tukizingatia alama 27 zilizothibitishwa, kwanza tulilinganisha wasifu wa PCA wa metabolomu za HC na BN sub-6 mm. Tuligundua kuwa sehemu nyingi za data za HC na BN ziliingiliana, ikionyesha kuwa viwango vya metaboliti katika seramu vilikuwa sawa katika vikundi vyote viwili (Mchoro 3a). Ramani za vipengele katika safu tofauti za ukubwa zilibaki zimehifadhiwa katika BN na LA (Mchoro 3b, c), ilhali utengano ulionekana kati ya vinundu vyenye madhara na visivyo hatarini katika safu ya 6-20 mm (Mchoro 3d). Kundi hili lilikuwa na AUC ya 0.927, umaalum wa 0.868, na unyeti wa 0.820 kwa ajili ya kutabiri uvimbe wenye madhara wa vinundu wenye ukubwa wa 6 hadi 20 mm (Mchoro 3e, f). Matokeo yetu yanaonyesha kuwa kiainishaji kinaweza kunasa mabadiliko ya kimetaboliki yanayosababishwa na mabadiliko ya mapema ya uvimbe wenye madhara, bila kujali ukubwa wa vinundu.
Ulinganisho wa wasifu wa PCA kati ya vikundi maalum kulingana na kiainishaji cha kimetaboliki cha metaboliti 27. CC na BN < 6 mm. b BN < 6 mm dhidi ya BN 6–20 mm. katika LA 6–20 mm dhidi ya LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm na LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Mkunjo wa sifa ya uendeshaji wa mpokeaji (ROC) unaoonyesha utendaji wa modeli tofauti kwa vinundu 6–20 mm. f Thamani za uwezekano zilihesabiwa kulingana na modeli ya urejeshaji wa vifaa kwa vinundu vinavyopima 6–20 mm. Mstari wenye nukta kijivu unawakilisha thamani bora ya kukata (0.455). Nambari zilizo hapo juu zinawakilisha asilimia ya kesi zilizotarajiwa kwa Los Angeles. Tumia jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili. PCA, uchambuzi wa vipengele vikuu. Eneo la AUC chini ya mkunjo. Data chanzo hutolewa katika mfumo wa faili za data chanzo.
Sampuli nne (wenye umri wa miaka 44-61) zenye ukubwa sawa wa vinundu vya mapafu (7-9 mm) zilichaguliwa zaidi ili kuonyesha utendaji wa modeli iliyopendekezwa ya utabiri wa ugonjwa mbaya (Mchoro 4a, b). Katika uchunguzi wa awali, Kesi ya 1 iliwasilishwa kama kinundu kigumu chenye kalsiamu, sifa inayohusiana na udhaifu, ilhali Kesi ya 2 iliwasilishwa kama kinundu kisichojulikana kwa sehemu kisicho na sifa dhahiri zisizo na madhara. Raundi tatu za uchunguzi wa CT uliofuata zilionyesha kuwa visa hivi vilibaki thabiti kwa kipindi cha miaka 4 na kwa hivyo vilizingatiwa kuwa vinundu visivyo na madhara (Mchoro 4a). Ikilinganishwa na tathmini ya kimatibabu ya uchunguzi wa mfululizo wa CT, uchambuzi wa metaboliti ya seramu ya risasi moja kwa kutumia modeli ya uainishaji wa sasa uligundua haraka na kwa usahihi vinundu hivi visivyo na madhara kulingana na vikwazo vya uwezekano (Jedwali 1). Mchoro 4b katika kesi ya 3 unaonyesha kinundu chenye dalili za kurudi nyuma kwa pleural, ambacho mara nyingi huhusishwa na ugonjwa mbaya32. Kesi ya 4 iliwasilishwa kama kinundu kisichojulikana kwa sehemu kisicho na madhara bila ushahidi wa sababu isiyo na madhara. Visa hivi vyote vilitabiriwa kuwa na madhara kulingana na modeli ya uainishaji (Jedwali 1). Tathmini ya adenocarcinoma ya mapafu ilionyeshwa kwa uchunguzi wa histopatholojia baada ya upasuaji wa kuondoa mapafu (Mchoro 4b). Kwa seti ya uthibitisho wa nje, kiainishaji cha kimetaboliki kilitabiri kwa usahihi visa viwili vya vinundu vya mapafu visivyojulikana zaidi ya 6 mm (Mchoro wa Nyongeza 10).
Picha za CT za dirisha la mhimili la mapafu la visa viwili vya vinundu visivyo na madhara. Katika kesi ya 1, CT scan baada ya miaka 4 ilionyesha kinundu imara chenye urefu wa milimita 7 na kalsiamu katika lobe ya chini ya kulia. Katika kesi ya 2, CT scan baada ya miaka 5 ilionyesha kinundu imara, chenye urefu wa milimita 7 katika lobe ya juu ya kulia. b Dirisha la mhimili Picha za CT za mapafu na tafiti zinazolingana za kipatholojia za visa viwili vya adenocarcinoma ya hatua ya I kabla ya upasuaji wa mapafu. Kesi ya 3 ilionyesha kinundu chenye kipenyo cha milimita 8 katika lobe ya juu ya kulia yenye uondoaji wa pleural. Kesi ya 4 ilionyesha kinundu cha glasi ya ardhini chenye urefu wa milimita 9 katika lobe ya juu ya kushoto. Madoa ya hematoksilini na eosini (H&E) ya tishu za mapafu zilizokatwa (upau wa kiwango = 50 μm) zinazoonyesha muundo wa ukuaji wa acinar wa adenocarcinoma ya mapafu. Mishale inaonyesha vinundu vilivyogunduliwa kwenye picha za CT. Picha za H&E ni picha zinazowakilisha mashamba mengi ya hadubini (>3) yaliyochunguzwa na mtaalamu wa magonjwa.
Kwa pamoja, matokeo yetu yanaonyesha thamani inayowezekana ya viashiria vya metaboliti katika seramu katika utambuzi tofauti wa vinundu vya mapafu, ambavyo vinaweza kusababisha changamoto wakati wa kutathmini uchunguzi wa CT.
Kulingana na paneli tofauti ya metaboliti iliyothibitishwa, tulijaribu kutambua uhusiano wa kibiolojia wa mabadiliko makubwa ya kimetaboliki. Uchambuzi wa uboreshaji wa njia ya KEGG uliofanywa na MetaboAnalyst ulibaini njia 6 za kawaida zilizobadilishwa kwa kiasi kikubwa kati ya makundi mawili yaliyotolewa (LA dhidi ya HC na LA dhidi ya BN, iliyorekebishwa p ≤ 0.001, athari > 0.01). Mabadiliko haya yalibainishwa na usumbufu katika metaboliti ya pyruvati, metaboliti ya tryptophan, metaboliti ya niacin na nikotinamidi, glikolisi, mzunguko wa TCA, na metaboliti ya purine (Mchoro 5a). Kisha tulifanya zaidi metaboliti zilizolengwa ili kuthibitisha mabadiliko makubwa kwa kutumia upimaji kamili. Uamuzi wa metaboliti za kawaida katika njia zilizobadilishwa kwa kawaida kwa kutumia spectrometry ya molekuli ya quadrupole tatu (QQQ) kwa kutumia viwango halisi vya metaboliti. Sifa za idadi ya watu za sampuli lengwa ya utafiti wa metabolomiki zimejumuishwa katika Jedwali la Ziada 4. Sambamba na matokeo yetu ya metabolomiki ya kimataifa, uchambuzi wa kiasi ulithibitisha kwamba hypoxanthine na xanthine, pyruvate, na lactate ziliongezeka katika LA ikilinganishwa na BN na HC (Mchoro 5b, c, p <0.05). Hata hivyo, hakuna tofauti kubwa katika metaboli hizi zilizopatikana kati ya BN na HC.
Uchambuzi wa uboreshaji wa njia ya KEGG wa metaboliti tofauti sana katika kundi la LA ikilinganishwa na vikundi vya BN na HC. Jaribio la Global lenye mikia miwili lilitumika, na thamani za p zilirekebishwa kwa kutumia mbinu ya Holm-Bonferroni (iliyorekebishwa p ≤ 0.001 na ukubwa wa athari > 0.01). b–d Violin plots zinazoonyesha viwango vya hypoxanthine, xanthine, lactate, pyruvate, na tryptophan katika seramu ya HC, BN, na LA iliyoamuliwa na LC-MS/MS (n = 70 kwa kila kikundi). Mistari nyeupe na nyeusi yenye madoadoa inaonyesha wastani na robo, mtawalia. e Violin plot inayoonyesha usemi wa kawaida wa Log2TPM (nakala kwa milioni) wa mRNA wa SLC7A5 na QPRT katika adenocarcinoma ya mapafu (n = 513) ikilinganishwa na tishu za kawaida za mapafu (n = 59) katika seti ya data ya LUAD-TCGA. Sanduku jeupe linawakilisha masafa ya kati ya robo, mstari mweusi mlalo katikati unawakilisha wastani, na mstari mweusi wima unaotoka kwenye sanduku unawakilisha kipindi cha kujiamini cha 95% (CI). f Mchoro wa uwiano wa Pearson wa usemi wa SLC7A5 na GAPDH katika adenocarcinoma ya mapafu (n = 513) na tishu ya kawaida ya mapafu (n = 59) katika seti ya data ya TCGA. Eneo la kijivu linawakilisha 95% CI. r, mgawo wa uwiano wa Pearson. g Viwango vya tryptophan ya seli vilivyorekebishwa katika seli za A549 vilivyohamishwa na udhibiti usio maalum wa shRNA (NC) na shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ulioamuliwa na LC-MS/MS. Uchambuzi wa takwimu wa sampuli tano zisizojitegemea kibiolojia katika kila kundi unawasilishwa. h Viwango vya seli vya NADt (jumla ya NAD, ikiwa ni pamoja na NAD+ na NADH) katika seli za A549 (NC) na seli za A549 za kushuka chini za SLC7A5 (Sh1, Sh2). Uchambuzi wa takwimu wa sampuli tatu zisizojitegemea kibiolojia katika kila kundi unawasilishwa. Shughuli ya glikolitiki ya seli za A549 kabla na baada ya kushuka kwa SLC7A5 ilipimwa kwa kiwango cha asidi ya nje ya seli (ECAR) (n = sampuli 4 zisizojitegemea kibiolojia kwa kila kundi). 2-DG,2-deoksi-D-glukosi. Jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili lilitumika katika (b–h). Katika (g–i), pau za makosa zinawakilisha wastani wa ± SD, kila jaribio lilifanywa mara tatu kwa kujitegemea na matokeo yalikuwa sawa. Data chanzo hutolewa katika mfumo wa faili za data chanzo.
Kwa kuzingatia athari kubwa ya kimetaboliki ya tryptophan iliyobadilika katika kundi la LA, pia tulipima viwango vya tryptophan katika seramu katika vikundi vya HC, BN, na LA kwa kutumia QQQ. Tuligundua kuwa tryptophan katika seramu ilipunguzwa katika LA ikilinganishwa na HC au BN (p < 0.001, Mchoro 5d), ambayo inaendana na matokeo ya awali kwamba viwango vya tryptophan vinavyozunguka ni vya chini kwa wagonjwa walio na saratani ya mapafu kuliko katika vidhibiti vyenye afya kutoka kwa kundi la udhibiti33,34,35. Utafiti mwingine kwa kutumia PET/CT tracer 11C-methyl-L-tryptophan uligundua kuwa muda wa kuhifadhi ishara ya tryptophan katika tishu za saratani ya mapafu uliongezeka sana ikilinganishwa na vidonda visivyo hatarishi au tishu za kawaida36. Tunadhani kwamba kupungua kwa tryptophan katika seramu ya LA kunaweza kuonyesha ufyonzwaji hai wa tryptophan na seli za saratani ya mapafu.
Pia inajulikana kwamba matokeo ya mwisho ya njia ya kynurenine ya ukataboli wa tryptophan ni NAD+37,38, ambayo ni sehemu muhimu ya mmenyuko wa glyceraldehyde-3-phosphate na 1,3-bisphosphoglycerate katika glycolysis39. Ingawa tafiti za awali zimezingatia jukumu la ukataboli wa tryptophan katika udhibiti wa kinga, tulitaka kufafanua mwingiliano kati ya dysregulation ya tryptophan na njia za glycolytic zilizoonekana katika utafiti wa sasa. Familia ya msafirishaji wa Solute 7 mwanachama 5 (SLC7A5) inajulikana kuwa msafirishaji wa tryptophan43,44,45. Asidi ya Quinolinic phosphoribosyltransferase (QPRT) ni kimeng'enya kilicho chini ya njia ya kynurenine ambayo hubadilisha asidi ya quinolinic kuwa NAMN46. Ukaguzi wa seti ya data ya LUAD TCGA ulionyesha kuwa SLC7A5 na QPRT zote ziliongezeka kwa kiasi kikubwa katika tishu za uvimbe ikilinganishwa na tishu za kawaida (Mchoro 5e). Ongezeko hili lilionekana katika hatua za I na II pamoja na hatua za III na IV za adenocarcinoma ya mapafu (Mchoro wa Nyongeza 11), ikionyesha usumbufu wa mapema katika umetaboli wa tryptophan unaohusishwa na uundaji wa uvimbe.
Zaidi ya hayo, seti ya data ya LUAD-TCGA ilionyesha uhusiano chanya kati ya usemi wa SLC7A5 na GAPDH mRNA katika sampuli za wagonjwa wa saratani (r = 0.45, p = 1.55E-26, Mchoro 5f). Kwa upande mwingine, hakuna uhusiano muhimu uliopatikana kati ya sahihi za jeni hizo katika tishu za kawaida za mapafu (r = 0.25, p = 0.06, Mchoro 5f). Kupungua kwa SLC7A5 (Mchoro wa Nyongeza 12) katika seli za A549 kulipunguza kwa kiasi kikubwa viwango vya tryptophan ya seli na NAD(H) (Mchoro 5g,h), na kusababisha shughuli ya glikolitiki iliyopunguzwa kama inavyopimwa na kiwango cha asidi ya nje ya seli (ECAR) (Mchoro 1). 5i). Kwa hivyo, kulingana na mabadiliko ya kimetaboliki katika seramu na ugunduzi wa ndani ya vitro, tunakisia kwamba kimetaboliki ya tryptophan inaweza kutoa NAD+ kupitia njia ya kynurenine na kuchukua jukumu muhimu katika kukuza glikolisisi katika saratani ya mapafu.
Uchunguzi umeonyesha kuwa idadi kubwa ya vinundu visivyojulikana vya mapafu vinavyogunduliwa na LDCT vinaweza kusababisha hitaji la upimaji wa ziada kama vile PET-CT, biopsy ya mapafu, na matibabu ya kupita kiasi kutokana na utambuzi wa uwongo wa ugonjwa wa saratani.31 Kama inavyoonyeshwa kwenye Mchoro 6, utafiti wetu ulibaini jopo la metaboliti za seramu zenye thamani inayowezekana ya utambuzi ambayo inaweza kuboresha uainishaji wa hatari na usimamizi unaofuata wa vinundu vya mapafu vinavyogunduliwa na CT.
Vinundu vya mapafu hupimwa kwa kutumia tomografia iliyokadiriwa kwa kipimo cha chini (LDCT) huku vipengele vya upigaji picha vikionyesha sababu zisizo na madhara au mbaya. Matokeo yasiyojulikana ya vinundu yanaweza kusababisha ziara za mara kwa mara za ufuatiliaji, uingiliaji kati usio wa lazima, na matibabu ya kupita kiasi. Kuingizwa kwa viainishaji vya kimetaboliki vya seramu vyenye thamani ya uchunguzi kunaweza kuboresha tathmini ya hatari na usimamizi unaofuata wa vinundu vya mapafu. Tomografia ya utoaji wa positron ya PET.
Takwimu kutoka kwa utafiti wa NLST wa Marekani na utafiti wa NELSON wa Ulaya zinaonyesha kwamba uchunguzi wa vikundi vilivyo katika hatari kubwa kwa kutumia kipimo kidogo cha tomografia iliyokadiriwa (LDCT) unaweza kupunguza vifo vya saratani ya mapafu1,3. Hata hivyo, tathmini ya hatari na usimamizi wa kimatibabu unaofuata wa idadi kubwa ya vinundu vya mapafu vinavyogunduliwa na LDCT vinabaki kuwa changamoto zaidi. Lengo kuu ni kuboresha uainishaji sahihi wa itifaki zilizopo zinazotegemea LDCT kwa kuingiza alama za kibiolojia zinazoaminika.
Baadhi ya alama za molekuli, kama vile metaboliti za damu, zimetambuliwa kwa kulinganisha saratani ya mapafu na vidhibiti vyenye afya15,17. Katika utafiti wa sasa, tulilenga utumiaji wa uchambuzi wa metaboliti za seramu ili kutofautisha kati ya vinundu visivyo na madhara na vibaya vya mapafu vilivyogunduliwa kwa bahati mbaya na LDCT. Tulilinganisha metaboliti ya seramu ya kimataifa ya udhibiti mzuri (HC), vinundu visivyo na madhara vya mapafu (BN), na sampuli za adenocarcinoma ya mapafu ya hatua ya I kwa kutumia uchambuzi wa UPLC-HRMS. Tuligundua kuwa HC na BN zilikuwa na wasifu sawa wa kimetaboliki, ilhali LA ilionyesha mabadiliko makubwa ikilinganishwa na HC na BN. Tulitambua seti mbili za metaboliti za seramu zinazotofautisha LA kutoka HC na BN.
Mpango wa sasa wa utambuzi wa vinundu visivyo na madhara na vyenye madhara unaotegemea LDCT unategemea zaidi ukubwa, msongamano, mofolojia na kiwango cha ukuaji wa vinundu baada ya muda. Uchunguzi wa awali umeonyesha kuwa ukubwa wa vinundu unahusiana kwa karibu na uwezekano wa saratani ya mapafu. Hata kwa wagonjwa walio katika hatari kubwa, hatari ya kupata uvimbe katika nodi <6 mm ni <1%. Hatari ya kupata uvimbe kwa vinundu vyenye ukubwa wa 6 hadi 20 mm ni kati ya 8% hadi 64%30. Kwa hivyo, Jumuiya ya Fleischner inapendekeza kipenyo cha mkato cha 6 mm kwa ufuatiliaji wa kawaida wa CT. 29 Hata hivyo, tathmini ya hatari na usimamizi wa vinundu visivyojulikana vya mapafu (IPN) vyenye ukubwa wa zaidi ya 6 mm haijafanywa vya kutosha 31. Usimamizi wa sasa wa ugonjwa wa moyo wa kuzaliwa kwa kawaida hutegemea kusubiri kwa uangalifu na ufuatiliaji wa mara kwa mara wa CT.
Kulingana na metabolome iliyothibitishwa, tulionyesha kwa mara ya kwanza mwingiliano wa saini za metabolome kati ya watu wenye afya njema na vinundu visivyo na madhara <6 mm. Kufanana kwa kibiolojia kunaendana na matokeo ya awali ya CT kwamba hatari ya uvimbe mbaya kwa vinundu <6 mm ni ndogo kama ilivyo kwa watu wasio na vinundu.30 Ikumbukwe kwamba matokeo yetu pia yanaonyesha kwamba vinundu visivyo na madhara <6 mm na ≥6 mm vina kufanana sana katika wasifu wa metabolome, ikidokeza kwamba ufafanuzi wa utendaji wa etiolojia isiyo na madhara ni thabiti bila kujali ukubwa wa vinundu. Kwa hivyo, paneli za kisasa za metaboliti za seramu zinaweza kutoa jaribio moja kama jaribio la kutotoka nje wakati vinundu vinagunduliwa mwanzoni kwenye CT na uwezekano wa kupunguza ufuatiliaji wa mfululizo. Wakati huo huo, jopo hilo hilo la biomarkers za kimetaboliki lilitofautisha vinundu vibaya ≥6 mm kwa ukubwa kutoka kwa vinundu visivyo na madhara na kutoa utabiri sahihi wa IPN za ukubwa sawa na sifa zisizoeleweka za kimofolojia kwenye picha za CT. Kiainishaji hiki cha kimetaboliki ya seramu kilifanya vizuri katika kutabiri uvimbe mbaya wa vinundu ≥6 mm na AUC ya 0.927. Kwa pamoja, matokeo yetu yanaonyesha kwamba saini za kipekee za kimetaboliki katika seramu zinaweza kuonyesha haswa mabadiliko ya kimetaboliki ya mapema yanayosababishwa na uvimbe na kuwa na thamani inayowezekana kama viashiria vya hatari, bila kujali ukubwa wa vinundu.
Ikumbukwe kwamba, adenokasinoma ya mapafu (LUAD) na saratani ya seli squamous (LUSC) ndizo aina kuu za saratani ya mapafu isiyo ya seli ndogo (NSCLC). Kwa kuzingatia kwamba LUSC inahusishwa sana na matumizi ya tumbaku47 na LUAD ndiyo histolojia ya kawaida ya vinundu vya mapafu vilivyogunduliwa kwenye uchunguzi wa CT48, modeli yetu ya uainishaji ilijengwa mahsusi kwa sampuli za adenokasinoma ya hatua ya I. Wang na wenzake pia walilenga LUAD na kutambua saini tisa za lipidi kwa kutumia lipidomics kutofautisha saratani ya mapafu ya hatua ya mapema na watu wenye afya njema17. Tulijaribu modeli ya sasa ya uainishaji katika visa 16 vya LUSC ya hatua ya I na vinundu 74 visivyo na madhara na tukaona usahihi mdogo wa utabiri wa LUSC (AUC 0.776), ikidokeza kwamba LUAD na LUSC zinaweza kuwa na saini zao za kimetaboliki. Hakika, LUAD na LUSC zimeonyeshwa kutofautiana katika etiolojia, asili ya kibiolojia na upotovu wa kijenetiki49. Kwa hivyo, aina zingine za histolojia zinapaswa kujumuishwa katika mifumo ya mafunzo ya kugundua saratani ya mapafu kulingana na idadi ya watu katika programu za uchunguzi.
Hapa, tulitambua njia sita zilizobadilishwa mara nyingi katika adenokasinoma ya mapafu ikilinganishwa na vidhibiti vyenye afya na vinundu visivyo na madhara. Xanthine na hypoxanthine ni metaboliti za kawaida za njia ya kimetaboliki ya purine. Sambamba na matokeo yetu, viambatanisho vinavyohusiana na kimetaboliki ya purine viliongezeka kwa kiasi kikubwa katika seramu au tishu za wagonjwa walio na adenokasinoma ya mapafu ikilinganishwa na vidhibiti vyenye afya au wagonjwa katika hatua ya kabla ya uvamizi15,50. Viwango vya juu vya xanthine na hypoxanthine katika seramu vinaweza kuonyesha anabolismi inayohitajika na seli za saratani zinazoongezeka kwa kasi. Uharibifu wa kimetaboliki ya glukosi ni sifa inayojulikana ya kimetaboliki ya saratani51. Hapa, tuliona ongezeko kubwa la pyruvate na lactate katika kundi la LA ikilinganishwa na kundi la HC na BN, ambalo linaendana na ripoti za awali za kasoro za njia ya glycolytic katika wasifu wa metabolome ya seramu ya wagonjwa wa saratani ya mapafu isiyo ya seli ndogo (NSCLC) na vidhibiti vyenye afya. matokeo ni thabiti52,53.
Muhimu zaidi, tuliona uhusiano tofauti kati ya kimetaboliki ya pyruvate na tryptophan katika seramu ya adenocarcinomas ya mapafu. Viwango vya tryptophan ya seramu vilipunguzwa katika kundi la LA ikilinganishwa na kundi la HC au BN. Cha kufurahisha, utafiti wa awali wa kiwango kikubwa kwa kutumia kundi linalotarajiwa uligundua kuwa viwango vya chini vya tryptophan inayozunguka vilihusishwa na hatari kubwa ya saratani ya mapafu. Tryptophan ni asidi amino muhimu ambayo tunapata kabisa kutoka kwa chakula. Tunahitimisha kuwa kupungua kwa tryptophan ya seramu katika adenocarcinoma ya mapafu kunaweza kuonyesha kupungua kwa haraka kwa metabolite hii. Inajulikana vyema kwamba matokeo ya mwisho ya ukataboli wa tryptophan kupitia njia ya kynurenine ndiyo chanzo cha usanisi mpya wa NAD+. Kwa sababu NAD+ huzalishwa hasa kupitia njia ya uokoaji, umuhimu wa NAD+ katika kimetaboliki ya tryptophan katika afya na magonjwa bado haujabainishwa46. Uchambuzi wetu wa hifadhidata ya TCGA ulionyesha kuwa usemi wa kisafirishaji cha solute cha tryptophan transporter 7A5 (SLC7A5) uliongezeka kwa kiasi kikubwa katika adenocarcinoma ya mapafu ikilinganishwa na vidhibiti vya kawaida na ulihusiana vyema na usemi wa kimeng'enya cha glycolytic GAPDH. Masomo ya awali yamelenga zaidi jukumu la ukataboli wa tryptophan katika kukandamiza mwitikio wa kinga dhidi ya uvimbe40,41,42. Hapa tunaonyesha kwamba kizuizi cha ufyonzaji wa tryptophan kwa kuangusha SLC7A5 katika seli za saratani ya mapafu husababisha kupungua kwa viwango vya NAD vya seli na kupungua kwa shughuli za glycolytic wakati huo huo. Kwa muhtasari, utafiti wetu unatoa msingi wa kibiolojia wa mabadiliko katika umetaboli wa seramu yanayohusiana na mabadiliko mabaya ya adenocarcinoma ya mapafu.
Mabadiliko ya EGFR ndiyo mabadiliko ya kawaida yanayosababisha mabadiliko kwa wagonjwa walio na NSCLC. Katika utafiti wetu, tuligundua kuwa wagonjwa walio na mabadiliko ya EGFR (n = 41) walikuwa na wasifu wa kimetaboliki kwa ujumla sawa na wagonjwa walio na EGFR ya aina ya porini (n = 31), ingawa tuligundua viwango vya kupungua kwa seramu ya baadhi ya wagonjwa walio na mabadiliko ya EGFR kwa wagonjwa wa acylcarnitine. Kazi iliyoanzishwa ya acylcarnitines ni kusafirisha vikundi vya acyl kutoka saitoplazimu hadi kwenye tumbo la mitochondrial, na kusababisha oxidation ya asidi ya mafuta ili kutoa nishati 55. Sambamba na matokeo yetu, utafiti wa hivi karibuni pia ulibaini wasifu sawa wa metabolomu kati ya uvimbe wa EGFR uliobadilika na EGFR wa aina ya porini kwa kuchanganua metabolomu ya kimataifa ya sampuli 102 za tishu za adenocarcinoma ya mapafu 50. Cha kufurahisha ni kwamba, kiwango cha acylcarnitine pia kilipatikana katika kundi la mabadiliko ya EGFR. Kwa hivyo, ikiwa mabadiliko katika viwango vya acylcarnitine yanaonyesha mabadiliko ya kimetaboliki yanayosababishwa na EGFR na njia za msingi za molekuli zinaweza kustahili utafiti zaidi.
Kwa kumalizia, utafiti wetu unaanzisha uainishaji wa kimetaboliki katika seramu kwa ajili ya utambuzi tofauti wa vinundu vya mapafu na unapendekeza mtiririko wa kazi ambao unaweza kuboresha tathmini ya hatari na kurahisisha usimamizi wa kimatibabu kulingana na uchunguzi wa CT scan.
Utafiti huu uliidhinishwa na Kamati ya Maadili ya Hospitali ya Saratani ya Chuo Kikuu cha Sun Yat-sen, Hospitali ya Kwanza ya Ushirika ya Chuo Kikuu cha Sun Yat-sen, na Kamati ya Maadili ya Hospitali ya Saratani ya Chuo Kikuu cha Zhengzhou. Katika vikundi vya ugunduzi na uthibitisho wa ndani, seramu 174 kutoka kwa watu wenye afya njema na seramu 244 kutoka kwa vinundu visivyo na madhara zilikusanywa kutoka kwa watu wanaofanyiwa uchunguzi wa kimatibabu wa kila mwaka katika Idara ya Kudhibiti na Kuzuia Saratani, Kituo cha Saratani cha Chuo Kikuu cha Sun Yat-sen, na seramu ya vinundu visivyo na madhara 166. Adenokasinoma ya mapafu ya Hatua ya I zilikusanywa kutoka Kituo cha Saratani cha Chuo Kikuu cha Sun Yat-sen. Katika kundi la uthibitishaji wa nje, kulikuwa na visa 48 vya vinundu visivyo na madhara, visa 39 vya adenokasinoma ya mapafu ya hatua ya I kutoka Hospitali ya Kwanza ya Ushirika ya Chuo Kikuu cha Sun Yat-sen, na visa 24 vya adenokasinoma ya mapafu ya hatua ya I kutoka Hospitali ya Saratani ya Zhengzhou. Kituo cha Saratani cha Chuo Kikuu cha Sun Yat-sen pia kilikusanya visa 16 vya saratani ya mapafu ya seli ya squamous ya hatua ya I ili kupima uwezo wa utambuzi wa kiainishaji cha kimetaboliki kilichoanzishwa (sifa za mgonjwa zinaonyeshwa katika Jedwali la Nyongeza 5). Sampuli kutoka kwa kundi la ugunduzi na kundi la uthibitishaji wa ndani zilikusanywa kati ya Januari 2018 na Mei 2020. Sampuli za kundi la uthibitishaji wa nje zilikusanywa kati ya Agosti 2021 na Oktoba 2022. Ili kupunguza upendeleo wa kijinsia, takriban idadi sawa ya visa vya wanaume na wanawake viliwekwa kwa kila kundi. Timu ya Ugunduzi na Timu ya Uhakiki wa Ndani. Jinsia ya washiriki iliamuliwa kulingana na ripoti ya kibinafsi. Ridhaa ya taarifa ilipatikana kutoka kwa washiriki wote na hakuna fidia iliyotolewa. Watu waliokuwa na vinundu visivyo na madhara walikuwa wale waliokuwa na alama thabiti ya CT scan katika miaka 2 hadi 5 wakati wa uchambuzi, isipokuwa kesi 1 kutoka kwa sampuli ya uthibitishaji wa nje, ambayo ilikusanywa kabla ya upasuaji na kugunduliwa na histopatholojia. Isipokuwa bronchitis sugu. Visa vya adenocarcinoma ya mapafu vilikusanywa kabla ya upasuaji wa mapafu na kuthibitishwa na utambuzi wa kiafya. Sampuli za damu ya kufunga zilikusanywa kwenye mirija ya kutenganisha seramu bila dawa zozote za kuzuia kuganda kwa damu. Sampuli za damu ziliganda kwa saa 1 kwenye joto la kawaida na kisha kuchujwa kwa senti kwenye 2851 × g kwa dakika 10 kwenye 4°C ili kukusanya dawa ya kuongeza nguvu kwenye seramu. Vipimo vya seramu viligandishwa kwenye -80°C hadi metaboliti itolewe. Idara ya Kuzuia Saratani na Uchunguzi wa Kimatibabu ya Kituo cha Saratani cha Chuo Kikuu cha Sun Yat-sen ilikusanya seramu kutoka kwa wafadhili 100 wenye afya njema, ikiwa ni pamoja na idadi sawa ya wanaume na wanawake wenye umri wa miaka 40 hadi 55. Kiasi sawa cha kila sampuli ya wafadhili kilichanganywa, seramu iliyotokana ilichujwa na kuhifadhiwa kwenye -80°C. Mchanganyiko wa seramu ulitumika kama nyenzo ya marejeleo kwa udhibiti wa ubora na usanifishaji wa data.
Sampuli za seramu ya marejeleo na majaribio ziliyeyushwa na metaboliti zilitolewa kwa kutumia mbinu ya pamoja ya uchimbaji (MTBE/methanol/maji) 56. Kwa kifupi, 50 μl ya seramu ilichanganywa na 225 μl ya methanoli ya barafu na 750 μl ya etha ya methyl tert-butyl ya barafu (MTBE). Koroga mchanganyiko na uanguke kwenye barafu kwa saa 1. Kisha sampuli zilichanganywa na vortex ikachanganywa na 188 μl ya maji ya daraja la MS yenye viwango vya ndani (13C-lactate, 13C3-pyruvate, 13C-methionine, na 13C6-isoleusini, iliyonunuliwa kutoka Maabara ya Isotope ya Cambridge). Mchanganyiko huo kisha ulizungushwa kwa centrifuge kwa 15,000 × g kwa dakika 10 kwa 4 °C, na awamu ya chini ilihamishiwa kwenye mirija miwili (125 μL kila moja) kwa ajili ya uchambuzi wa LC-MS katika hali chanya na hasi. Hatimaye, sampuli ilivukizwa hadi ikauke katika kizingatio cha utupu cha kasi ya juu.
Metaboliti zilizokaushwa ziliundwa upya katika mililita 120 za asetonitrile 80%, zikatolewa kwa mvuke kwa dakika 5, na kuzungushwa kwa centrifuge kwa 15,000 × g kwa dakika 10 kwa joto la 4°C. Supernatants zilihamishiwa kwenye vikombe vya glasi ya kahawia vyenye viingilio vidogo kwa ajili ya masomo ya metabolomiki. Uchambuzi wa metabolomiki usiolengwa kwenye jukwaa la chromatografia ya kioevu yenye utendaji wa hali ya juu-azimio kubwa (UPLC-HRMS). Metaboliti zilitenganishwa kwa kutumia mfumo wa Dionex Ultimate 3000 UPLC na safu wima ya ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Maji). Katika hali chanya ya ioni, awamu zinazotembea zilikuwa 95% (A) na 50% asetonitrile (B), kila moja ikiwa na 10 mmol/L amonium acetate na 0.1% asidi fomik. Katika hali hasi, awamu zinazohamishika A na B zilikuwa na asetonitrile 95% na 50%, mtawalia, awamu zote mbili zilikuwa na asetoni ya amonia 10 mmol/L, pH = 9. Programu ya gradient ilikuwa kama ifuatavyo: dakika 0–0.5, 2% B; dakika 0.5–12, 2–50% B; dakika 12–14, 50–98% B; dakika 14–16, 98% B; dakika 16–16.1., 98–2% B; dakika 16.1–20, 2% B. Safu wima ilidumishwa kwa 40°C na sampuli kwa 10°C kwenye sampuli otomatiki. Kiwango cha mtiririko kilikuwa 0.3 ml/dakika, kiasi cha sindano kilikuwa 3 μl. Spektromita ya wingi ya Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) yenye chanzo cha ionisheni ya kunyunyizia umeme (ESI) iliendeshwa katika hali kamili ya kuchanganua na kuunganishwa na hali ya ufuatiliaji ya ddMS2 ili kukusanya kiasi kikubwa cha data. Vigezo vya MS viliwekwa kama ifuatavyo: volteji ya kunyunyizia +3.8 kV/- 3.2 kV, halijoto ya kapilari 320°C, gesi ya kuilinda arb 40, gesi saidizi arb 10, halijoto ya hita ya probe 350°C, kiwango cha kuchanganua 70–1050 m/h, azimio. 70 000. Data zilipatikana kwa kutumia Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Ili kutathmini ubora wa data, sampuli za udhibiti wa ubora zilizokusanywa (QC) zilitolewa kwa kuondoa 10 μL aliquots za supernatant kutoka kwa kila sampuli. Sindano sita za sampuli za udhibiti wa ubora zilichambuliwa mwanzoni mwa mfuatano wa uchambuzi ili kutathmini uthabiti wa mfumo wa UPLC-MS. Sampuli za udhibiti wa ubora kisha huingizwa mara kwa mara kwenye kundi. Makundi yote 11 ya sampuli za seramu katika utafiti huu yalichambuliwa na LC-MS. Makundi mengine ya mchanganyiko wa dimbwi la seramu kutoka kwa wafadhili 100 wenye afya yalitumika kama nyenzo ya marejeleo katika makundi husika ili kufuatilia mchakato wa uchimbaji na kurekebisha athari za kundi hadi kundi. Uchambuzi wa metabolomics usiolengwa wa kundi la ugunduzi, kundi la uthibitisho wa ndani, na kundi la uthibitisho wa nje ulifanywa katika Kituo cha Metabolomics cha Chuo Kikuu cha Sun Yat-sen. Maabara ya nje ya Kituo cha Uchambuzi na Upimaji cha Chuo Kikuu cha Guangdong cha Teknolojia pia ilichanganua sampuli 40 kutoka kundi la nje ili kujaribu utendaji wa modeli ya uainishaji.
Baada ya uchimbaji na uundaji upya, kipimo kamili cha metaboliti za seramu kilipimwa kwa kutumia spectrometry ya chromatografia ya kioevu yenye utendaji wa hali ya juu-sanjari (Agilent 6495 triple quadrupole) yenye chanzo cha ionization ya electrospray (ESI) katika hali ya ufuatiliaji wa mmenyuko mingi (MRM). Safu wima ya ACQUITY BEH Amide (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Maji) ilitumika kutenganisha metaboliti. Awamu ya kuhama ilikuwa na 90% (A) na 5% asetonitrile (B) yenye 10 mmol/L acetate ya ammonium na 0.1% amonia myeyusho. Programu ya gradient ilikuwa kama ifuatavyo: dakika 0–1.5, 0% B; dakika 1.5–6.5, 0–15% B; dakika 6.5–8, 15% B; dakika 8–8.5, 15%–0% B; dakika 8.5–11.5, 0% B. Safu wima ilidumishwa kwa 40 °C na sampuli kwa 10 °C kwenye sampuli otomatiki. Kiwango cha mtiririko kilikuwa 0.3 mL/dakika na ujazo wa sindano ulikuwa 1 μL. Vigezo vya MS viliwekwa kama ifuatavyo: volteji ya kapilari ±3.5 kV, shinikizo la nebulizer 35 psi, mtiririko wa gesi ya ala 12 L/dakika, halijoto ya gesi ya ala 350 °C, halijoto ya gesi ya kukausha 250 °C, na mtiririko wa gesi ya kukausha 14 l/dakika. Mabadiliko ya MRM ya tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine na xanthine yalikuwa 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 na 151.0–107.9 mtawalia. Data zilikusanywa kwa kutumia Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Kwa sampuli za seramu, tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine, na xanthine zilipimwa kwa kutumia mikunjo ya urekebishaji wa myeyusho wa kawaida wa mchanganyiko. Kwa sampuli za seli, kiwango cha tryptophan kilirekebishwa kuwa cha kawaida kwa kiwango cha ndani na uzito wa protini ya seli.
Uchimbaji wa kilele (m/z na muda wa kuhifadhi (RT)) ulifanywa kwa kutumia Compound Discovery 3.1 na TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Ili kuondoa tofauti zinazowezekana kati ya makundi, kila kilele cha sifa cha sampuli ya jaribio kiligawanywa na kilele cha sifa cha nyenzo ya marejeleo kutoka kundi moja ili kupata wingi wa jamaa. Mkengeuko wa kawaida wa viwango vya ndani kabla na baada ya usanifishaji umeonyeshwa katika Jedwali la Nyongeza 6. Tofauti kati ya makundi hayo mawili zilibainishwa na kiwango cha ugunduzi wa uongo (FDR<0.05, mtihani wa cheo uliosainiwa na Wilcoxon) na mabadiliko ya mara (>1.2 au <0.83). Data ghafi ya MS ya vipengele vilivyotolewa na data ya MS iliyorekebishwa na seramu ya marejeleo imeonyeshwa katika Data ya Nyongeza 1 na Data ya Nyongeza 2, mtawalia. Maelezo ya kilele yalifanywa kulingana na viwango vinne vilivyoainishwa vya utambulisho, ikiwa ni pamoja na metaboliti zilizotambuliwa, misombo iliyoelezwa kwa njia ya kudhaniwa, madarasa ya misombo yaliyobainishwa kwa njia ya kudhaniwa, na misombo isiyojulikana 22. Kulingana na utafutaji wa hifadhidata katika Ugunduzi wa Kiwanja 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), misombo ya kibiolojia yenye viwango vilivyothibitishwa vinavyolingana na MS/MS au maelezo halisi yanayolingana katika mzCloud (alama > 85) au Chemspider hatimaye ilichaguliwa kama wa kati kati ya metabolome tofauti. Maelezo ya kilele kwa kila kipengele yamejumuishwa katika Data ya Ziada 3. MetaboAnalyst 5.0 ilitumika kwa uchanganuzi wa univariate wa wingi wa metaboliti uliosawazishwa kwa jumla. MetaboAnalyst 5.0 pia ilitathmini uchanganuzi wa uboreshaji wa njia ya KEGG kulingana na metaboliti tofauti sana. Uchanganuzi mkuu wa vipengele (PCA) na uchanganuzi mdogo wa miraba midogo (PLS-DA) ulichambuliwa kwa kutumia kifurushi cha programu cha ropls (v.1.26.4) pamoja na urekebishaji wa mrundikano na uongezaji otomatiki. Mfano bora wa biomarker ya metaboliti kwa ajili ya kutabiri uvimbe wa vinundu ulitolewa kwa kutumia urejeshaji wa vifaa vya binary na opereta wa angalau kupungua kabisa na uteuzi (LASSO, kifurushi cha R v.4.1-3). Utendaji wa modeli ya ubaguzi katika seti za kugundua na kuthibitisha ulibainishwa kwa kukadiria AUC kulingana na uchambuzi wa ROC kulingana na kifurushi cha pROC (v.1.18.0.). Kikomo bora cha uwezekano kilipatikana kulingana na faharisi ya juu ya Youden ya modeli (unyeti + umaalum - 1). Sampuli zenye thamani ndogo au kubwa kuliko kizingiti zitatabiriwa kama vinundu visivyo na madhara na adenocarcinoma ya mapafu, mtawalia.
Seli za A549 (#CCL-185, Mkusanyiko wa Utamaduni wa Aina ya Marekani) zilikuzwa katika hali ya kati ya F-12K iliyo na 10% FBS. Mfuatano wa RNA fupi ya nywele (shRNA) inayolenga SLC7A5 na kidhibiti kisicholenga (NC) ziliingizwa kwenye vekta ya lentiviral pLKO.1-puro. Mfuatano wa antisense wa shSLC7A5 ni kama ifuatavyo: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Kingamwili za SLC7A5 (#5347) na tubulin (#2148) zilinunuliwa kutoka kwa Teknolojia ya Ishara ya Seli. Kingamwili za SLC7A5 na tubulin zilitumika kwa mchanganyiko wa 1:1000 kwa uchambuzi wa Western blot.
Kipimo cha Mkazo cha Seahorse XF Glycolytic Stress hupima viwango vya asidi ya nje ya seli (ECAR). Katika kipimo, glukosi, oligomycin A, na 2-DG zilitolewa mfululizo ili kupima uwezo wa glikoliti ya seli kama ilivyopimwa na ECAR.
Seli za A549 zilizohamishwa kwa kutumia udhibiti usiolenga (NC) na shSLC7A5 (Sh1, Sh2) ziliwekwa usiku kucha katika vyombo vyenye kipenyo cha sentimita 10. Metaboliti za seli zilitolewa kwa kutumia 1 ml ya methanoli ya maji yenye barafu yenye 80%. Seli katika myeyusho wa methanoli zilikwanguliwa, zikakusanywa kwenye mrija mpya, na kuzungushwa kwa centrifuge kwa 15,000 × g kwa dakika 15 kwa 4°C. Kusanya 800 µl ya supernatant na kukaushwa kwa kutumia kizingatio cha utupu cha kasi ya juu. Vidonge vya metaboliti vilivyokaushwa vilichambuliwa kwa viwango vya tryptophan kwa kutumia LC-MS/MS kama ilivyoelezwa hapo juu. Viwango vya NAD(H) vya seli katika seli za A549 (NC na shSLC7A5) vilipimwa kwa kutumia kipima rangi cha NAD+/NADH (#K337, BioVision) kulingana na maagizo ya mtengenezaji. Viwango vya protini vilipimwa kwa kila sampuli ili kurekebisha kiasi cha metaboliti.
Hakuna mbinu za takwimu zilizotumika kubaini ukubwa wa sampuli awali. Uchunguzi wa awali wa metabolomiki uliolenga ugunduzi wa biomarker15,18 umezingatiwa kama vigezo vya kubaini ukubwa, na ikilinganishwa na ripoti hizi, sampuli yetu ilikuwa ya kutosha. Hakuna sampuli zilizotengwa kutoka kwa kundi la utafiti. Sampuli za seramu ziliwekwa kwa nasibu kwa kundi la ugunduzi (kesi 306, 74.6%) na kundi la uthibitisho wa ndani (kesi 104, 25.4%) kwa masomo ya metabolomiki yasiyolengwa. Pia tulichagua kwa nasibu kesi 70 kutoka kwa kila kundi kutoka kwa seti ya ugunduzi kwa masomo ya metabolomiki yaliyolengwa. Wachunguzi walipofushwa kwa mgawo wa kikundi wakati wa ukusanyaji na uchambuzi wa data ya LC-MS. Uchambuzi wa takwimu wa data ya metabolomiki na majaribio ya seli umeelezewa katika sehemu husika za Matokeo, Hadithi za Kielelezo, na Mbinu. Upimaji wa tryptophan ya seli, NADT, na shughuli ya glycolytic ulifanywa mara tatu kwa kujitegemea na matokeo sawa.
Kwa maelezo zaidi kuhusu muundo wa utafiti, tazama Muhtasari wa Ripoti ya Kwingineko Asilia inayohusiana na makala haya.
Data ghafi ya MS ya vipengele vilivyotolewa na data ya MS iliyorekebishwa ya seramu ya marejeleo imeonyeshwa katika Data ya Nyongeza 1 na Data ya Nyongeza 2, mtawalia. Maelezo ya kilele ya vipengele tofauti yamewasilishwa katika Data ya Nyongeza 3. Seti ya data ya LUAD TCGA inaweza kupakuliwa kutoka https://portal.gdc.cancer.gov/. Data ya kuingiza kwa ajili ya kuchora grafu imetolewa katika data chanzo. Data chanzo imetolewa kwa makala haya.
Kundi la Kitaifa la Utafiti wa Uchunguzi wa Mapafu, n.k. Kupunguza vifo vya saratani ya mapafu kwa kutumia kipimo kidogo cha tomografia iliyokadiriwa. Uingereza Kaskazini. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR na Prophet, PC Uchunguzi wa saratani ya mapafu kwa kutumia kipimo cha chini cha CT ya helical: matokeo kutoka Utafiti wa Kitaifa wa Uchunguzi wa Mapafu (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Kupunguza vifo kutokana na saratani ya mapafu kwa kutumia uchunguzi wa CT wa kiasi kikubwa katika jaribio lisilo la kawaida. Uingereza Kaskazini. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Muda wa chapisho: Septemba 18-2023